Irradiação UV: Um método para integrar matrizes extracromosômicas

Overview

A microinjeção de transgenes geralmente resulta em cepas de C. elegans com grandes matrizes extracromosomais, que resultam em expressão variável e transmissão do transgene.  A irradiação UV pode induzir a integração cromossômica da matriz e a transmissão transgênica mais estável.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Mariol et al, Um Protocolo Rápido para Integrar Matrizes Extracromosomais com Alta Taxa de Transmissão no Genoma C. elegans , J. Vis. Exp. (2013).

1. Irradiação UV e Recuperação de Vermes Transgênicos

1. Irradiação de vermes:
   1. Escolha 30-100 animais transgênicos fluorescentes L4 em placas de cultura separadas (15-20 animais por placa).
   2. Coloque as placas, com as tampas removidas, em um cruzador UV. Irradie os vermes em 0,012 J/cm². Observe que as cepas são mais ou menos sensíveis à UV e que os resultados podem ser variáveis dependendo do irradiador UV utilizado. Uma faixa de dose entre 0,010-0,015 J/cm² pode ser testada.
2. Recuperação de vermes após a irradiação:
   1. Coloque placas com vermes irradiados durante a noite a 15 °C para recuperação.
   2. Verifique o número de animais que estão vivos. Em nossas mãos, uma taxa de sobrevivência de cerca de 80-90% é adaptada para uma irradiação eficiente.
   3. Cresça os animais irradiados a 15-25 °C até que a prole chegue ao estágio de desenvolvimento permitindo a observação da expressão do marcador de coinjeção.

2. Isolamento de linhas transgênicas integradas

1. Seleção de animais de F1:
   1. Único 150-200 animais fluorescentes F1 em placas de cultura separadas. Para linhas altamente transmissoras (≥80%), 100 animais de F1 são suficientes.
   2. Mantenha estas placas de F1 a 15-25 °C até que a prole atinja um estágio apropriado para a observação de animais F2 fluorescentes.
   3. Descarte todas as placas de F1 que não apresentem prole, indicando que o animal de F1 era estéril ou morreu, ou ii) não ou apenas poucos animais fluorescentes de F2, indicando que o animal de F1 não transmitiu o transgene na taxa esperada. Esta etapa é rápida e representa uma vantagem real quando comparada ao protocolo padrão que requer uma estimativa da porcentagem de vermes F2 fluorescentes para selecionar placas de F1 exibindo ≥ 75% progênero fluorescente(Tabela 1).
2. Seleção de animais F2:
   1. Quatro animais F2 transgênicos fluorescentes de cada placa F1 selecionada. Ao usar transgenes fluorescentes (por exemplo mCherry, gfp ou dsRed), escolha vermes F2 com um alto nível de fluorescência, pois isso pode indicar que esses animais são homozigosos para a matriz integrada. Observe que ao escolher animais F2 é fundamental não transportar ovos ou larvas, a fim de evitar falsos negativos no próximo passo.
   2. Cresça animais F2 a 15-25 °C.
3. Isolamento e validação de cepas transgênicas integradas:
   1. Tela placas F2 para vermes F3 transgênicos 100% fluorescentes. A tela é bastante rápida, pois a presença de um único verme não fluorescente indica que a placa deve ser jogada fora. Um animal F2 homozigos para o transgene integrado dará prole fluorescente 100% homozigosa.
   2. Cada oito animais F3 fluorescentes de placas selecionadas para confirmar a herança 100% do transgene. Em teoria, escolher um animal é suficiente nesta etapa. No entanto, a colheita de oito animais F3 fluorescentes pode ser necessária para evitar a seleção de animais não-fértil ou insalubres, pois a irradiação pode induzir aleatoriamente mutações que afetam genes importantes para a fisiologia dos vermes.
   3. Se possível, mantenha várias cepas transgênicas integradas independentes, ou seja, cepas recuperadas de diferentes animais de F1.

Representative Results

Mesa 1. Comparação dos protocolos padrão e aprimorados para integração de matrizes extracromosômicas aogenomade C. elegans. Dois transgênicos não integrados que transmitiam na mesma frequência foram integrados utilizando o padrão ou o protocolo melhorado. A principal diferença está no fato de que no protocolo padrão é realizada uma tela da prole em todas as placas de F1 para estimar a porcentagem de vermes F2 transgênicos, que devem ser ≥ 75%. Este passo leva muito tempo, especialmente se a taxa inicial de transmissão estiver próxima de 75%. No protocolo melhorado, basta identificar quatro vermes F2 de cada placa F1 que transportam animais F2 transgênicos e testar 100% dos vermes transgênicos na prole (F3), que podem ser realizados rapidamente. O protocolo padrão é adaptado.  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms