UV-bestrålning: En metod för att integrera extrakromosommatriser

Overview

Mikroinjektion av transgener resulterar vanligtvis i C. elegans stammar med stora extrachromosomal arrays, vilket resulterar i varierande uttryck och överföring av transgen.  UV-bestrålning kan inducera kromosomintegration av matrisen och stabilare transgeneöverföring.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Mariol et al, A Rapid Protocol for Integrateing Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome, J. Vis. Exp. (2013).

1. UV-bestrålning och återhämtning av transgena maskar

1. Mask bestrålning:
   1. Välj 30-100 fluorescerande transgena L4-djur på separata odlingsplattor (15-20 djur per tallrik).
   2. Placera plattorna, med locken borttagna, i en UV-korslänkare. Bestråla maskarna på 0.012 J/cm². Observera att stammar är mer eller mindre känsliga för UV och att resultaten kan variera beroende på vilken UV-bestrålare som används. Ett dosområde mellan 0,010-0,015 J/cm² kan testas.
2. Återhämtning av maskar efter bestrålning:
   1. Placera plattor med bestrålade maskar över natten vid 15 °C för återhämtning.
   2. Kontrollera om det finns djur som lever. I våra händer är en överlevnadsgrad på cirka 80-90% anpassad för en effektiv bestrålning.
   3. Odla de bestrålade djuren vid 15-25 °C tills avkomman har nått utvecklingsstadiet vilket möjliggör observation av myntmarkeringsuttrycket.

2. Isolering av integrerade transgena linjer

1. Urval av F1-djur:
   1. Enstaka 150-200 fluorescerande F1-djur på separata odlingsplattor. För mycket överförande linjer (≥80%), 100 F1 djur räcker.
   2. Förvara dessa F1-plattor vid 15-25 °C tills avkomman når ett lämpligt stadium för observation av fluorescerande F2-djur.
   3. Kassera alla F1-plattor som uppvisar antingen i) ingen avkomma, vilket indikerar att F1-djuret var sterilt eller dött, eller ii) inga eller endast få fluorescerande F2-djur, vilket indikerar att F1-djuret inte överför transgenet i förväntad takt. Detta steg är snabbt och representerar en verklig fördel jämfört med standardprotokollet som kräver en uppskattning av andelen fluorescerande F2-maskar för att välja F1-plattor som uppvisar ≥75% fluorescerande avkomma (tabell 1).
2. Urval av F2-djur:
   1. Enstaka fyra fluorescerande transgena F2-djur från varje vald F1-platta. När du använder fluorescerande transgener (till exempel mCherry, gfp eller dsRed), välj F2-maskar med hög fluorescens eftersom detta kan indikera att dessa djur är homozygous för den integrerade matrisen. Observera att när man plockar F2-djur är det viktigt att inte bära med ägg eller larver, för att undvika falska negativ i nästa steg.
   2. Odla F2 djur vid 15-25 °C.
3. Isolering och validering av integrerade transgena stammar:
   1. Skärm F2-plattor för 100% fluorescerande transgena F3-maskar. Skärmen är ganska snabb eftersom närvaron av en enda icke-fluorescerande mask indikerar att plattan ska kastas bort. En F2 djur homozygous för den integrerade transgenen kommer att ge 100% homozygous fluorescerande avkomma.
   2. Enstaka åtta fluorescerande F3-djur från utvalda plattor för att bekräfta 100% arv av transgenen. I teorin räcker det att välja ett djur i detta steg. Att välja åtta fluorescerande F3-djur kan dock vara nödvändigt för att undvika att välja ofruktbara eller ohälsosamma djur eftersom bestrålning slumpmässigt kan inducera mutationer som påverkar gener som är viktiga för maskfysiologi.
   3. Om möjligt behålla flera oberoende integrerade transgena stammar, dvs.

Representative Results

Tabell 1. Jämförelse av standard och förbättrade protokoll för extrachromosomal arrays integration i C. elegans genomet. Två ickeintegrerade transgener som sänder med ungefär samma frekvens integrerades med hjälp av standarden eller det förbättrade protokollet. Den största skillnaden ligger i det faktum att i standardprotokollet utförs en skärm av avkomman på alla F1-plattor för att uppskatta andelen transgena F2-maskar, som bör ≥ 75%. Detta steg tar lång tid, särskilt om den ursprungliga överföringshastigheten är nära 75%. I det förbättrade protokollet är det tillräckligt att singel fyra F2-maskar från varje F1-platta som bär transgena F2-djur och att screena för 100% av transgena maskar i avkomman (F3), som kan utföras snabbt. Standardprotokollet är anpassat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms