Test di risposta optocinetica: un metodo per misurare l'acuità visiva in Zebrafish

Overview

Questo video descrive il saggio di risposta optocinetica nel pesce zebra. Il video misura i movimenti riflessivi degli occhi in base allo stimolo visivo in movimento e determina l'acuità visiva nel pesce zebra.

Protocol

1.Risposta optocinetica (OKR)

1. Costruisci il dispositivo di registrazione OKR personalizzato utilizzando un tamburo rotante di 14,5 cm di diametro, un microscopio stereo con impostazioni di intensità della luce regolabili (300-8.000 lux) e un computer(Figura 1A).
   1. Collegare una fotocamera al microscopio che fornirà un feed live su un monitor adiacente e consentirà l'acquisizione e la registrazione delle immagini.
   2. Controllare il tamburo rotante utilizzando un microcontrollore collegato a un computer che può ospitare varie selezioni di velocità e direzione.
2. Anestetizzare il pesce nello 0,016% di tricaina per 2-3 minuti e quindi posizionare il pesce su una piccola piattaforma con gli occhi e le branchie sospesi sul bordo.
3. Posizionare una spugna / asciugamano sottile sul corpo del pesce e pin 2-3 pezzi di schiuma, sagomati per ospitare il pesce, sopra il pesce per tenerlo immobilizzato. Limitare il movimento della coda del pesce è risultato essere un aspetto cruciale per l'immobilizzazione senza causare lesioni al pesce, ed è stato raggiunto al meglio usando un pezzo piatto di schiuma. (Figura 1B)
4. Posizionare il pesce all'interno di un serbatoio cilindrico pieno d'acqua, che si inserisce all'interno del tamburo rotante del dispositivo di registrazione OKR. Utilizzare magneti sulla piattaforma per posizionare il pesce in posizione verticale, con gli occhi a circa 7,3 cm dal bordo del tamburo. Il pesce dovrebbe rivivere dall'anestesia entro pochi minuti - riprenderà la respirazione normale e dovrebbero essere osservati movimenti casuali degli occhi.
5. Posizionare una griglia di base di 0,07 cicli per grado (cpd) nel tamburo rotante e attivare i comandi del computer per iniziare la rotazione e l'acquisizione video (per questo foglio è stata utilizzata una velocità di 12 giri/min, ma velocità di 8-16 giri/min dovrebbero dare risultati simili).
6. Una volta che un OKR iniziale viene suscitato dalla griglia di base, mettere in pausa brevemente la rotazione e sostituire la griglia con una griglia più piccola (frequenza spaziale più elevata).
7. Ripetere questo processo fino a quando non è più possibile ottenere un OKR. Riprovare con la griglia più piccola che ha causato un OKR seguendo un approccio scala modificato e quindi ripetere utilizzando la griglia che non è riuscita a ottenere una risposta per verificare la perdita dell'OKR. Questo processo può essere ripetuto per verificare una vera risposta alla griglia rilevabile più piccola se la griglia finale è cambiata rispetto al primo evento di estinzione.
8. Ottenere misurazioni dell'acuità monocolare posizionando un occluder di plastica nera sulle strisce adiacenti all'occhio opposto. Ripetere la procedura precedente (passaggi 1.6-1.7).
9. Ottenere l'acuità dell'occhio opposto riposizionando l'occluder e ripetendo nuovamente i passaggi 1.6-1.7.
10. Si noti la distanza di ogni occhio dalle strisce durante la procedura di prova utilizzando il nastro di misura di riferimento sotto il serbatoio del pesce in modo che le misure di acuità accurate possano essere calcolate nei seguenti passaggi.

2. Calcolo dell'acuità visiva

1. Ottenere l'acuità visiva calcolando il cpd: dove a è la distanza dal centro dell'obiettivo alla griglia, e h è la lunghezza di un ciclo della griglia più piccola in cui è stato osservato OKR (Figura 1C).
2. Per le misurazioni combinate dell'acuità visiva, viene utilizzato il valore a medio dell'occhio sinistro e destro.

Representative Results

Figura 1. Registrazione OKR. A) Il dispositivo OKR è costituito da un tamburo rotante e un microscopio da 14,5 cm di diametro con impostazioni regolabili dell'intensità della luce (300-8.000 lux). Una fotocamera fornisce un feed live su un monitor adiacente. Il tamburo rotante ha varie impostazioni di velocità sia in senso orario che antiorario e le griglie di frequenza spaziale intercambiabili vengono inserite e rimosse in base alle esigenze. B)I pesci sono fissati e posizionati al centro del tamburo rotante. C) I cicli per grado (cpd) vengono calcolati utilizzando cpd=

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Super Low Light Black White Video Security Camera	Super Circuits	PC164CEX-2	Any low light camera may be used
Arduino Duemilanove microcontroller	Adafruit Industries		The Arduino Uno is also compatible with the speed control software.
Tricaine Methanesulfonate	VWR	101107-950