Gerichte leverablatie: inducerende hepatocytdood met metronidazol in transgene zebravislarven

Overview

Het artikel beschrijft gerichte leverablatie, een methode voor het induceren van hepatocytdood met metronidazol in transgene zebravislarven. Het monsterprotocol beschrijft het proces voor het genereren, manipuleren en beoordelen van gerichte leverablatie bij zebravissen.

Protocol

1. Bereiding van embryo's/larven

1. Breng 100 embryo's over in een petrischaaltje van 100 mm met 25 ml eiwater. Bewaar niet meer dan 100 embryo's per petrischaaltje en verhoog ze op 28 °C.
2. Om pigmentatie te remmen, voegt u fenylthiourea (PTU) toe aan de petrischalen vóór 10 uur na de bevruchting (hpf) en verhoogt u embryo's/larven tot 80 hpf. De uiteindelijke concentratie van PTU is 0,2 mM.
   LET OP: PTU is giftig. Gebruik in overeenstemming met de juiste behandelingsrichtlijnen.
3. Verdoof de larven door 3-aminobenzoëzuur ethylester (Tricaine), bij een uiteindelijke concentratie van 0,016%, toe te voegen aan de petrischaaltjes. Sorteer vervolgens met behulp van een epifluorescentiemicroscoop GVB-positieve larven. Gebruik larven met een vergelijkbare levergrootte en gooi die met een kleinere of grotere lever weg.
   OPMERKING: alle GVB-positieve larven, ongeacht de intensiteit, kunnen worden gebruikt omdat er geen verschil is in de mate van hepatocytablatie tussen de hemizygous en homozygote larven.
   LET OP: tricaine is giftig. Gebruik in overeenstemming met de juiste behandelingsrichtlijnen.
4. Verwijder het eiwater dat Tricaine bevat en voeg eiwater toe aangevuld met 0,2 mM PTU. Houd de embryo's/larven op 28 °C.

2. Mtz Behandeling

1. Bereid verse 10 mM Mtz-oplossing door 0,171 g Mtz-poeder op te lossen in 100 ml eiwater aangevuld met 0,2% DMSO en 0,2 mM PTU. Om de Mtz volledig op te lossen, mengt u de oplossing bij RT met snel roeren gedurende 20-30 minuten. Om Mtz te helpen solubiliseren en om Mtz-permeatie in de larven te verbeteren, voegt u DMSO toe bij het bereiden van Mtz.
   LET OP: langdurige blootstelling of verhoogde concentratie Mtz is giftig. Gebruik in overeenstemming met de juiste behandelingsrichtlijnen.
2. Scheid de larven in controle- en experimentele groepen door het gewenste aantal larven over te brengen in twee verschillende petrischaaltjes van 100 mm of een bord met meerdere putten. Houd voor de experimentele groep de larven in 10 mM Mtz-oplossing; voor de controlegroep, bewaar ze in eiwater met 0,2% DMSO.
3. Bedek de platen of petrischalen met de Mtz-oplossing met aluminiumfolie om de foto-inactivatie van Mtz te voorkomen en incubeer bij 28 °C. De duur van de Mtz-behandeling hangt af van het larvale stadium en de transgene lijn.

3. Analyse van galgestuurde leverregeneratie

1. Verwijder aan het einde van de ablatieperiode de Mtz-oplossing van de platen. Was de met Mtz behandelde larven door 25 ml eiwater toe te voegen. Wervel de plaat 2-3 keer om de larven te wassen voordat je het eiwater weggooit. Herhaal dit drie keer en dompel de larven vervolgens nog een keer onder in eiwater. Om hartoedeem en larvale dood in de met Mtz behandelde larven te voorkomen, voegt u een lagere concentratie Tricaine toe, bij een uiteindelijke concentratie van 0,008%, om de larven te immobiliseren.
2. Onderzoek voor leveranalyse de levergrootte van de met Mtz behandelde larven onder een epifluorescentiemicroscoop met het GVB-filter. Beoordeel de ablatieniveaus van hepatocyten op basis van de relatieve levergrootte: groot (niet-ablated; 0-10% larven), gemiddeld (gedeeltelijk ablated; 10-20%), en zeer klein (volledig ablated; 80-90%).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA