층별 한천 마운팅: 반전된 현미경으로 장기간 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 준비

Overview

이 문서는 장기 화상 진찰을 위한 살아있는 제브라피시 배아를 탑재하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 반전 현미경에 이미징을위한 일반 유리 바닥 현미경 요리를 사용하여 비용 효과적이고 수행하기 쉽습니다. 마운팅은 다른 농도에서 아가로즈층에서 수행됩니다.

Protocol

1. 배아 준비

1. 짝짓기 후, 페트리 접시에 E3에서 배아를 수확하고 장착하기 전에 약 28 시간 동안 26.5 ° C에서 배양하십시오.
   참고: 이것은 배아가 화상 진찰의 시작에 대략 30 somite 단계에 있다는 것을 그래서 태아의 발달을 감속합니다.
2. E3에서 0.016-0.020% 트리카인에서 배아를 마취합니다. 색소 침착을 억제하려면 200 μM의 농도에 PTU를 추가하십시오.
3. 해부 현미경의 밑에 집게를 사용하여 배아를 dechorionate. 두 개의 집게를 사용하여, 그립과 부드럽게 배아를 해제하기 위해 떨어져 초리온을 당깁니다.

2. 아가로즈 에 장착

참고: 개발된 마운팅 방법은 필요에 따라 0.02% 트리카인과 PTU를 갖춘 E3의 저용 아가로즈 의 두 가지 농도를 필요로 한다. 첫 번째 아가로즈 용액에는 왜곡과 운동성이 최소한인 아가로즈의 최적 농도가 포함되어 있습니다. 최적화는 아래 5단계에서 설명됩니다.

1. 두 층 (아래 5 단계 및 1%에 정의 된 농도)에 대한 아가로즈 용액을 가열하십시오. 65 °C. 아가로즈가 장착 직전에 약 30°C까지 식혀 배아가 열에 의해 손상되지 않도록 하십시오. 장착을 위해 0번 커버 유리 바닥이 있는 35mm 유리 바닥 요리를 사용하십시오. 접시 바닥에 부착된 커버 글래스는 배아를 배치할 수 있는 10mm 얕은(깊이 약 1.2mm)을 잘 만듭니다.
   참고: 이 경우, 운동성 및 왜곡이 가장 적은 농도는 0.025~0.040% 아가로산하였다.
2. 유리 파이펫 이나 마이크로 피펫을 사용 하 여 접시의 바닥에 그것의 측면 중 하나와 함께 부드럽게 비반향 배아를 배치 합니다. 마이크로피펫을 사용하는 경우, 배아(도1A)에맞게 개구부 크기를 증가시키기 위해 팁의 바깥 부분을 자른다. 마이크로파이펫으로 남은 E3를 조심스럽게 제거합니다.
3. 배아(도 1B)를 커버하기 위해 접시 바닥에 부착된 커버 글래스에 의해 생성된 작은우물에 제1아가로즈 용액을 첨가한다. 아가로즈가 작은 우물을 커버하지만 오버플로하지 않습니다 있는지 확인합니다.
4. 커버 글래스(22mm x 22mm)(도1C)로작은 우물을 덮어 두 개의 커버 안경 사이에 배아로 채워진 좁은 아가로즈를 만듭니다.
5. 1% 아가로즈 용액을 접시 의 바닥에 커버 글래스 위에 놓습니다(도1D). 이 층이 고화화되면 커버 글래스를 제자리에 고정합니다.
6. 0.02% 트리카인을 함유한 E3로 나머지 부분을 채우고 시스템을 수분화(도 3)(도1E)한다.
   참고: 이 설정에서 커버 유리와 1 % 아가로즈는 바닥 층이 희석되지 않도록 보호합니다.

3. 레이어 1용 아가로즈 솔루션 최적화

1. 레이어 1에 대한 아가로즈의 최적의 농도를 식별하려면 다중 규모의 그리드 검색 방법을 사용합니다. 아가로즈 농도가 증가하여 0.01%에서 1%까지, 배아 성장 제한 및 시야의 운동성의 시간 경과 이미징이 뒤따릅니다. 왜곡과 운동성이 최소화된 농도를 식별합니다.
2. 아가로즈의 농도를 더욱 최적화하기 위해, 아가로즈 농도의 더 미세한 범위를 사용하여 배아를 탑재(예를 들어, 0.025~0.040% 아가로즈 사이) 농도에 따라 3.1단계(예: 0.025%, 0.028%, 0.031% 등)에서 가장 좋은 것으로 나타났다.
   참고: 우리의 실험실에서, 최적의 아가로즈 농도는 약 0.03%였다.

Representative Results

그림 1 : 장착 방법에 대한 설명. (A) 35mm 접시의 유리 바닥에 의해 생성된 작은 우물에 제브라피쉬 배아를 넣습니다. (B) 아가로즈 층 1을 작은 우물에 추가하여 배아를 덮습니다. (C) 조심스럽게 작은 우물 위에 커버 유리를 배치합니다. (D) 35mm 접시의 전체 하단에 아가로즈 층 2를 추가합니다. (E) 요리에 E3를 추가합니다. (F) 마운팅 설정의 단면의 회로도 도면. (G) 최종 몽타주에서 제브라피시 배아의 현미경 이미지(5배 목표).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067