דיסקציה מוחית של דגי זברה: טכניקה של נוירוביולוגיה של דגים

Abstract

מקור: Lopez-Ramirez M. A. et. al., בידוד ותרבות של נוירוספרות מוחיות של דגי זברה בוגרים. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של מיקרודיסקציה של המוח מדג זברה בוגר. שיטה זו מסייעת בהשגת נויאורוספירות שמקורן במוח שלם שניתן ללמוד עוד יותר.

Protocol

1. דיסקציה של מוח דג הזברה הבוגר

1. הכינו מיטת דיסקציה על ידי מילוי צלחת פטרי בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ באריזות קרח ג'ל. לאחר מכן מניחים את המכסה על צלחת הפטרי ודגרים ב -20 מעלות צלזיוס עד שהג'ל קופא. על גבי המכסה מניחים ריבוע של נייר סינון נקי ועוטפים הן את נייר הסינון והן את צלחת הפטרי בסרט פלסטיק.
2. נקו ועיקרו את כל מכשירי המיקרודיסקציה ב-70% אתנול או בחום לפני כל שימוש. הניחו את כל מכשירי הדיסקציה המעוקרים ליד המיקרוסקופ המנתח, וממש לפני המתת חסד, הניחו את מיטת הדיסקציה מתחת למיקרוסקופ עם תאורת סיבים אופטיים.
3. אספו 2 דגי זברה בוגרים להכנת נוירוספרה שלמה במוח; ו-3 עד 4 דגי זברה כדי ליצור נוירוספרות מאזורי מוח מנותחים.
4. יש להרדים דגי זברה בוגרים (בני 8-12 חודשים) באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. לאחר מכן, לטבול את הדג באתנול 75% למשך 5-10 שניות ולהניח במהירות במיטת הדיסקציה ואחריה עריפת ראש בגובה הזימים באמצעות להב כירורגי.
   1. כדי להרדים בעלי חיים, יש לתת מנת יתר (300 מ"ג/ליטר) של טריקאין מתאן-סולפונט עד שקצב פעימות הלב של בעל החיים מאט בהדרגה וזרימת הדם נעצרת, ואז לטבול במי קרח.
5. סובבו את הצד הגבי של הראש כלפי מטה, ובעזרת המספריים בצעו חיתוך אורכי מהצד החתוך אל הפה. באמצעות המלקחיים חושפים את בסיס הגולגולת ומסירים את כל הרקמה הסמוכה. חותכים את הדפנות הרוחביות של הגולגולת מתחילת חוט השדרה לכיוון הטקטום.
6. באמצעות המספריים, לחתוך ולהסיר את עצבי הראייה ולאחר מכן להסיר את שני הצדדים של החלק הצדדי ביותר של הגולגולת ברמה של טקטום. סובב את הצד הגחוני של הראש כלפי מעלה. בעזרת מלקחיים, לקלף את שאר החלק האפי ביותר של הגולגולת.
7. מעבירים את המוח יחד עם החלק הנותר של הגולגולת לצלחת חדשה עם מדיום הדיסקציה (DMEM/F12 עם פניצילין/סטרפטומיצין). נקו את רקמת המוח במדיום הדיסקציה באמצעות ידית הפלסטיק של סכין המיקרו, תוך שמירה על שלמות כל מבני המוח.
8. מנקודה זו, המשיכו את הפרוטוקול באמצעות כל המוח של דגי הזברה.
   1. לחלופין, התאימו את הפרוטוקול הזה לאזורים מסוימים במוח כדי ליצור נוירוספרות ממוח של דגי זברה שלמים או מטלנצפלון, טקטום/דיאנצפלון או המוח הקטן שנחתחו בעזרת אזמל טרי. השתמשו בקו עצבי ספציפי של דג זברה פלואורסצנטי כדי לנתח את האזור המעניין במוח לפי איור 1.

Results

איור 1: התמיינות של נוירוספרות שמקורן במוח של דגי זברה.(A-C, E) תמונות ניגודיות פאזה של נוירוספרות שלמות שמקורן במוח שגודלו בתרבית בתווך התמיינות Z במהלך 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) ו-4 (C ו-D, DiVd4). (E) מבט גבי על כל המוח של דג זברה Tg (GFAP:DsRed) בן 12 חודשים. הטלנספלון (Tel), הטקטום...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	לייף טכנולוגיות	11330-032
פניצילין-סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות	15140-122
טריקאין MS-222	סיגמא	A5040	תמיסת מלאי של 4 מ"ג/מ"ל