ゼブラフィッシュの脳解剖:魚の神経生物学の技術

Abstract

出典:Lopez-Ramirez M. A. et. al., Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres.J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオでは、成魚のゼブラフィッシュの脳を微視する技術について説明しています。この方法は、さらに研究できる全脳由来のニューオロスフェアを取得するのに役立ちます。

Protocol

1. ゼブラフィッシュの成体脳の解剖

1. 100 mm x 15 mmのペトリ皿にジェルアイスパックを充填して、解剖ベッドを準備します。次に、蓋をシャーレに置き、ゲルが凍結するまで-20°Cでインキュベートします。蓋の上にきれいな濾紙の正方形を置き、濾紙とペトリ皿の両方をプラスチックフィルムで包みます。
2. すべてのマイクロダイセクション機器は、使用前に毎回70%エタノールまたは熱で洗浄および滅菌してください。滅菌したすべての解剖器具を解剖顕微鏡の近くに置き、安楽死の直前に、解剖床を光ファイバー照明付きの顕微鏡の下に置きます。
3. 2匹の成魚を採取して全脳神経球を調製し、3〜4匹のゼブラフィッシュを採取して解剖した脳領域からニューロスフェアを作製します。
4. 成体のゼブラフィッシュ(生後8〜12か月)を、施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して安楽死させます。次に、魚を75%エタノールに5〜10秒間浸し、解剖ベッドにすばやく置き、続いて外科用ブレードを使用して鰓のレベルで斬首します。
   1. 動物を安楽死させるには、動物の心臓の鼓動が徐々に遅くなり、循環が止まるまでトリカインメタンスルホン酸の過剰摂取(300 mg / L)を投与し、その後、氷水に浸します。.
5. 頭の背側を下にして、ハサミで切り口から縦に切り込みを入れます。鉗子を使用すると、頭蓋骨の基部が露出し、隣接するすべての組織が除去されます。頭蓋骨の側壁を脊髄の始まりから蓋に向かって切り取ります。
6. ハサミを使用して、視神経を切断して取り除き、次に蓋蓋骨のレベルで頭蓋骨の最も外側の部分の両側を取り除きます。頭の腹側を上に向けます。鉗子を使用して、頭蓋骨の最も先端部分の残りの部分をはがします。
7. 頭蓋骨の残りの部分とともに脳を解剖培地(DMEM/F12とペニシリン/ストレプトマイシン)を備えた新しい皿に移します。マイクロナイフのプラスチック製のハンドルを使用して、解剖液中の脳組織を洗浄し、すべての脳構造を無傷に保ちます。
8. この時点から、ゼブラフィッシュの脳全体を使用してプロトコルを続けます。
   1. あるいは、このプロトコルを特定の脳領域に適応させて、ゼブラフィッシュの脳全体から、または新鮮なメスで解剖した終脳、蓋骨/間脳、または小脳からニューロスフェアを生成します。図1に示すように、神経特異的な蛍光ゼブラフィッシュ神経トランスジェニック系統を使用して、関心のある脳領域を解剖します。

Results

図1:ゼブラフィッシュの脳由来ニューロスフェアの分化。(A-C, E) Z分化培地で1日(A, DiVd1)、3日(B、DiVd3)、4日(CおよびD、DiVd4)に培養した全脳由来ニューロスフェアの位相差画像。(E) 生後12ヶ月のTg(GFAP:DsRed)ゼブラフィッシュの全脳の背側図。図のように、終脳(Tel)、tectum(Tec)、および小脳(Cer)を解剖し、収集しました。(D)通路0(P0)、1(P1)、および2(P2)の蓋、終脳、小脳から得られたDiVd4ニューロスフェアの画像。スケールバー:25μm。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	ライフテクノロジー	11330-032
ペニシリン-ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140-122
トリカインMS-222	シグマ	A5040 (英語)	4 mg / mlの原液