Disección del cerebro del pez cebra: una técnica de neurobiología de peces

Abstract

Fuente: Lopez-Ramirez M. A. et. al., Aislamiento y cultivo de neuroesferas derivadas del cerebro del pez cebra adulto. J. Vis. Exp. (2016).

Este video describe la técnica de microdisección del cerebro de un pez cebra adulto. Este método ayuda a obtener neuorosferas derivadas de todo el cerebro que se pueden estudiar más a fondo.

Protocol

1. Disección del cerebro del pez cebra adulto

1. Prepare un lecho de disección llenando una placa de Petri de 100 mm x 15 mm con bolsas de hielo en gel. A continuación, coloque la tapa en la placa de Petri e incube a -20 °C hasta que el gel se congele. Encima de la tapa, coloque un cuadrado de papel de filtro limpio y envuelva tanto el papel de filtro como la placa de Petri con una película de plástico.
2. Limpie y esterilice todos los instrumentos de microdisección con etanol al 70% o caliente antes de cada uso. Coloque todos los instrumentos de disección esterilizados cerca del microscopio de disección y, justo antes de la eutanasia, coloque la cama de disección debajo del microscopio con iluminación de fibra óptica.
3. Recolecta 2 peces cebra adultos para una preparación de la neurosfera de todo el cerebro; y de 3 a 4 peces cebra para generar neuroesferas a partir de regiones cerebrales disecadas.
4. Eutanasiar al pez cebra adulto (8-12 meses de edad) utilizando un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. A continuación, sumerja el pez en etanol al 75% durante 5-10 segundos y colóquelo rápidamente en el lecho de disección seguido de la decapitación a nivel de las branquias con una cuchilla quirúrgica.
   1. Para sacrificar a los animales, administre una sobredosis (300 mg/L) de metanosulfonato de tricaína hasta que los latidos del corazón del animal se ralenticen gradualmente y la circulación se detenga, luego sumérjalo en agua helada.
5. Gira la cabeza con el lado dorsal hacia abajo y, con las tijeras, haz un corte longitudinal desde el lado cortado hasta la boca. Con las pinzas, exponga la base del cráneo y extraiga todo el tejido adyacente. Corta las paredes laterales del cráneo desde el comienzo de la médula espinal hacia el tectum.
6. Con las tijeras, corte y retire los nervios ópticos y luego retire ambos lados de la parte más lateral del cráneo a nivel del tectum. Gira la cabeza con el lado ventral hacia arriba. Con pinzas, despegue el resto de la parte más apical del cráneo.
7. Transfiera el cerebro junto con la parte restante del cráneo a una nueva placa con el medio de disección (DMEM / F12 con penicilina / estreptomicina). Limpie el tejido cerebral en el medio de disección con el mango de plástico del microcuchillo, manteniendo intactas todas las estructuras cerebrales.
8. A partir de este punto, continúe el protocolo utilizando todo el cerebro del pez cebra.
   1. Alternativamente, adapte este protocolo a regiones específicas del cerebro para generar neuroesferas a partir de cerebro completo de pez cebra o a partir del telencéfalo, tectum/diencéfalo o cerebelo diseccionado con un bisturí nuevo. Utilice una línea transgénica neuronal fluorescente de pez cebra específica para diseccionar la región del cerebro de interés, de acuerdo con la Figura 1.

Results

Figura 1: Diferenciación de las neuroesferas derivadas del cerebro del pez cebra.(A-C, E) Imágenes de contraste de fase de neuroesferas enteras derivadas del cerebro cultivadas en el medio de diferenciación Z durante 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) y 4 (C y D, DiVd4) días. (E) Vista dorsal de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Tecnologías de la Vida	11330-032
Penicilina-estreptomicina	Tecnologías de la Vida	Números 15140-122
Tricaína MS-222	sigma	A5040	Solución madre de 4 mg/ml