Cet article détaillera le protocole de mesure de l'activité calpaïne dans les cellules fixes et de vie en utilisant la cytométrie de flux.
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Article de méthode
Mesure de l'activité calpaïne dans des cellules fixées et de la Vie par cytométrie en flux
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les calpaïnes sont omniprésents intracellulaire, sensible au calcium, cystéine-protéases neutres
Protocole
Préparer des réactifs
Note: Tous PBS contient Ca 2 + et Mg 2 +
- Réactif de détection
Ajouter 20μM 7-amino-4-chlorométhyl coumarine, t-BOC-Leucine-méthionine amide (BOC-LM-CMAC) à la température ambiante du PBS. Chaque suspension cellulaire exigera réactif de détection 2mL. - Paraformaldéhyde 1% (cellules fixées)
Diluer 4% paraformaldéhyde solution stock à la température ambiante du PBS. Paraformaldéhyde Aliquoter 1mL de 1% à chaque tube FACS. Trois tubes FACS sont requis pour chaque condition expérimentale (ex. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 besoin de 9 tubes FACS) - P....
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Discussion
L'activité calpaïne dans les cellules 32Dkit fixe et la vie a été déterminée dans ce protocole vidéo. Traitement de la lignée cellulaire avec l'inhibiteur de calpaïnes PD150606 entraîné une inhibition complète de l'activité calpaïne dans les cellules. En outre, le traitement avec l'inhibiteur de MEK1 PD98059 entraîné une inhibition complète de l'activité calpaïne dans les cellules. ERK est un important activateur de la calpaïne-2 3. Ces résultats suggèrent que l'activité calpaïne-2 est.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Soutenu par des subventions des Instituts canadiens de recherche en santé, La Société de leucémie et lymphome du Canada et la Fondation Lymphome du Canada.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4 % paraformaldéhyde | Invitrogen | Dissoudre 4 g de paraformaldéhyde dans 100 mL de PBS. Dans la hotte, chauffer l'échantillon avec agitation jusqu'à obtention d'une solution limpide. Laisser refroidir, puis conserver à 4 °C.°C | |
| PD150606 | Invitrogen | Utilisez du PD150606 fraîchement reconstitué pour une inhibition maximale de la calpaïne. | |
| PD98059 | Cell Signaling Technology | ||
| AlignFlow, AlignFlow plus tubes FACS avec billes fluorescentes | Invitrogen | ||
| LSR II | BD Biosciences | Le surnageant de cellules WEHI-3 est utilisé comme source d'IL-3 dans ces expériences. Chaque prélèvement de surnageant de WEHI-3 est titré afin de déterminer la concentration optimale utilisée pour la croissance des cellules 32Dkit. |
Références
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P.
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Réimpressions et autorisations
