הצלה של שפעת וירוסים מ-DNA פלסמיד היא טכניקה ניסויית בסיסי וחיוני המאפשר לחוקרים שפעת לייצר וירוסים רקומביננטי ללמוד היבטים מרובים הביולוגיה של נגיף השפעת, וכן לשמש וקטורים או חיסונים פוטנציאליים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מאמצים על ידי מספר קבוצות מחקר שפעת כבר מרכזי פיתוח ושיפור של שפעת A גנטיקה הפוכה וירוס. הוקמה במקור בשנת 1999
פרוטוקול
1. הצלה וירוס שפעת transfection
נגיף שפעת שייך למשפחת Orthomyxoviridae שלילי של גדילי RNA וירוסים אפוף. שפעת A בגנום הנגיף מורכב משמונה גנים שונים של RNA קוטביות שלילית המקודדים, לפחות, 11 חלבונים נגיפיים (איור 1) 4. אנו נתמקד, בדוח זה, על חילוץ של אחד המתח מעבדה הנפוצים ביותר, שפעת A/PR/8/34, 5 באמצעות פלסמידים ambisense (pDZ) המכיל את 8 שפעת A/PR/8/34 קטעים ויראליים ( איור 2).
להצלת נגיפי שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד, אנו ממליצים על 3 transfections עצמאית לכל וי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההצלה של נגיפי שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד הוא תהליך פשוט וברור פעם פרוטוקול מבוצע באופן שגרתי במעבדה, אבל בהתחלה, דברים רבים יכולים להשתבש. זה הכרחי להיות הכנה טובה פלסמיד כדי ליצור את הנגיף. תחזוקה נכונה של שורות תאים (293T ו MDCK) הוא חיוני להצלת ויראלי מוצלח. באופן מסורתי, תג גנטי מוחדר שפעת הגן קידוד פלסמיד, על ידי mutagenesis שקט. מבוא של מוטציה זו שותק (ים) ויצירת, למשל, הגבלה רומן אתר אנזים המשמש להבחין בין wild-type ו - וירוס השפעת רקומביננטי על ידי אנזים העיכול. לכן, לא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
הר סיני הספר לרפואה של בעל זכויות הקניין הרוחני בתחום של נגיפי שפעת רקומביננטי, AG ו-S הוא ממציא בקניין רוחני זה.
תודות
המחברים רוצה להודות לחברי בעבר ובהווה של אדולפו גרסיה-סאסטרה ופיטר Palese מעבדות לפיתוח טכניקות שפעת הפוך גנטיקה פלסמידים. מחקר AG-S מעבדות ממומנת בחלקה על ידי נכה, מרכז NIAID במימון מצוינות למחקר שפעת ומעקב (HHSN266200700010C) וכן על ידי מענקים NIAD R01AI046954, U01AI070469 ו P01AI058113. מחקר LM-S מעבדה ממומנת חלקית על ידי מענק NIAID RO1AI077719.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
שורות תאים
293T (מספר קטלוג CRL-11268) ו MDCK (מספר קטלוג CCL-34) שורות תאים נשמרות 37 ° C חממה עם 5 CO 2% DMEM 10% FBS, PS 1%. תאים הם צורה זמין סוג התרבות האמריקאית אוסף (ATCC, 10801 אוניברסיטת שדרות, Manassas, VA. 20110-2209 ארה"ב).
עוף וביצים Embryonated
Embryonated 10 יום בן ביצי תרנגולת ניתן לקבל צ'ארלס ריבר מעבדות, העופות ספציפי פתוגן אגרת התשלום (SPAFAS) העופות מוצרים ושירותים. פרנקלין מלאי, 106 כביש 32, צפון פרנקלין, CT 06254 ארה"ב. ביצים מודגרת ב 37 ° C הקודמת ואחרי זיהום ויראלי. לפני ואחרי זיהום ויראלי, בדק את הביצים כדי לקבוע את הכדאיות של העוברים. חשוב מאוד לחפש ביצים מת לפני ואחרי זיהום ויראלי. לפני זיהום ביצה מת ניתן הבחין בקלות על ידי בהעדר כלי הדם, כמו גם העדר ניידות העובר. כאשר בדק את, עוברים לגור לזוז. לאחר זיהום ויראלי ביצה מת (כנראה קשור זיהום בנגיף שפעת) יהיה הבחין בקלות על ידי הופעתו של ביצה רע כפי שהוא נראה על ידי נפח קטן של נוזל דם allantoic. אינפקטד, ביצים מושלכות בשקיות autoclavable כפול autoclaved הבאים נהלים סטנדרטיים.
עוף אדום דם תאים (RBC)
עוף RBC ניתן לרכוש חוות Truslow, 201 כביש בעמק, Chestertown, MD 21620. חנות ב 4 ° C. עבור מבחני HA, לשטוף 5 מ"ל של RBC עוף עם 45 מ"ל של PBS 1X בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1000 rpms, RT. מחק בזהירות את supernatant ולהשתמש דילול 1:1000 של RBC pelleted ב PBS 1X (הריכוז הסופי של RBC 0.5-1.0%).
תרבות רקמות ונוזלים supernatants allantoic
שניהם, תרבות supernatants רקמות ונוזלים allantoic ניתן לאחסן 4 ° C למשך תקופה קצרה של זמן. לאחר אישור הצלה וירוס, וירוסים supernatants תא או נוזל allantoic מאוחסנים ב -80 ° C.
פלסמידים
כל פלסמידים מוכנים באמצעות המלצות maxi פלסמיד ערכת הבא של היצרן. פלסמידים כל aliquot בריכוזים של 1 מיקרוגרם / מ"ל ב DDH 2 O ו המאוחסן ב -20 ° C. עבור אחסון לטווח קצר, פלסמיד ניתן לשמור על 4 ° C. הריכוז של ה-DNA פלסמיד מטוהרים נקבעת על ידי לספקטרופוטומטריה ב 260 ננומטר, עם טוהר להיות מוערך באמצעות יחס 260:280 ננומטר. תכשירים עם 260:280 יחס 1.8-2.0 ננומטר נחשבים הופקע למטרות הצלה וירוס. בנוסף, ריכוז טוהר פלסמיד ויש אישר agarose עם ג'ל כרומטוגרפיה. Ambisense pDZ פלסמידים (6) המכיל שמונה שפעת A/PR/8/34 גנים ויראליים (7) הן באיור 2.
וירוסים
הפרוטוקול המתואר להצלת שפעת A/PR/8/34 יכול להתבצע תחת biosafety רמה (מנהלת הליגה) 2 תנאים. חומר מזוהם, כולל תרבות supernatants רקמות ביצים embryonated, יש לעקר לפני סילוק. ההצלה של וירוס השפעת אחרים עשויים לדרוש תנאים מנהלת הליגה גבוהה יותר, ולכן, תנאים מיוחדים / מדידות הביטחון יהיה צורך אחר.
תרבות רקמות התקשורת ופתרונות
DMEM 10% FBS PS 1%: 445 מ"ל מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM), 50 מ"ל של סרום שור עוברית (FBS), ו - 5 מ"ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין (PS). חנות ב 4 ° C. מדיה זה ישמש כדי לשמור על התאים 293T ו MDCK וכן transfections. DMEM BA 0.3% 1% נ.ב.: 495.7 מ"ל של DMEM, 4.3 מ"ל של 35% שור אלבומין (BA). חנות ב 4 ° C. רק לפני השימוש, מוסיפים טריפסין TPCK שטופלו לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל. זיהומיות התקשורת.
פוספט 10X שנאגרו מלוחים (PBS): 80 גרם של NaCl, 2 גרם של KCl, 11.5 גרם של Na 2 HPO 4 0.7 H 2 O, 2 גרם של KH 2 PO 4. הוסף DDH 2 O עד 1 ליטר. התאם ל-pH 7.3. לעקר ידי החיטוי. אחסן בטמפרטורת החדר.
1X PBS: 10X PBS לדלל 1:10 עם DDH 2 O. לעקר ידי החיטוי ולאחסן בטמפרטורת החדר.
מקורות
- Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).
- Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
