הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Summary

הצלה של שפעת וירוסים מ-DNA פלסמיד היא טכניקה ניסויית בסיסי וחיוני המאפשר לחוקרים שפעת לייצר וירוסים רקומביננטי ללמוד היבטים מרובים הביולוגיה של נגיף השפעת, וכן לשמש וקטורים או חיסונים פוטנציאליים.

Abstract

מאמצים על ידי מספר קבוצות מחקר שפעת כבר מרכזי פיתוח ושיפור של שפעת A גנטיקה הפוכה וירוס. הוקמה במקור בשנת 1999

Protocol

1. הצלה וירוס שפעת transfection

נגיף שפעת שייך למשפחת Orthomyxoviridae שלילי של גדילי RNA וירוסים אפוף. שפעת A בגנום הנגיף מורכב משמונה גנים שונים של RNA קוטביות שלילית המקודדים, לפחות, 11 חלבונים נגיפיים (איור 1) ^4. אנו נתמקד, בדוח זה, על חילוץ של אחד המתח מעבדה הנפוצים ביותר, שפעת A/PR/8/34, ⁵ באמצעות פלסמידים ambisense (pDZ) המכיל את 8 שפעת A/PR/8/34 קטעים ויראליים ( איור 2).

להצלת נגיפי שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד, אנו ממליצים על 3 transfections עצמאית לכל וירוס כל רקומביננטי. אם אחד או יותר הצלה וירוס רקומביננטי הוא ניסה, היקף הצעדים הבאים accordantly למספר וירוסים להינצל. Transfection הבאים פרוטוקול זיהום הוא הוקם עבור 6-היטב צלחות. ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מתוארת באיור 3.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) תערובת: הכן 250 μl של התקשורת OptiMEM ו 6-8 μl של transfection LPF2000 לכל. דגירה למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בינתיים, מכינים את תערובת transfection פלסמיד.
2. תערובת transfection פלסמיד: הכן את קוקטייל transfection פלסמיד ב 50 μl של התקשורת OptiMEM. בדרך כלל אנו משתמשים 1 מיקרוגרם של ה-DNA כל שפעת פלסמיד לכל ההצלה. הוסף 1 μl של פלסמידים pDZ (ב 1 מיקרוגרם / μl) PB2, PB1, הרשות הפלסטינית, HA, NP, NA, M, ו - NS אל צינור המכיל 50 μl של התקשורת OptiMEM.
3. OptiMEM-LPF2000-DNA פלסמיד תערובת: הוסף 250 μl 1.1 משלב את התערובת לתוך פלסמיד דנ"א transfection שפעת (שלב 1.2). דגירה זה התערובת במשך 20-30 דקות בכל RT. בינתיים, להכין את המתלים של תאים 293T ו MDCK עבור transfection.
4. הכנה של תרבות שיתוף 293T/MDCK: לפני שמתחילים, להביא את 1X PBS, DMEM 10% FBS 1% PS התקשורת, EDTA-טריפסין תערובת עד 37 ° C. צפיפות התאים צריך להיות בנקודת המפגש 80-90% ביום transfection. בדרך כלל, צלחת אחת ומחוברות 100 מ"מ של 293T אחד צלחת ומחוברות 100 מ"מ של תאים MDCK יכול לשמש מציל 10-12. אנחנו הולכים להשתמש 250 μl של תאים לכל טוב. שתי שורות תאים יהיה resuspended בסך של 3 מ"ל של DMEM 10% FBS PS 1%.
   • בזהירות resuspend כל שורה תא 10 מ"ל של DMEM 10% FBS PS 1% צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. תצטרך שפופרת אחת עבור תאים 293T ואחד צינור עבור תאים MDCK.
   • Resuspend התאים 293T ב 3 מ"ל של DMEM 10% FBS PS 1% וכאשר resuspended, לספק את מ"ל 3 לתאי MDCK כדי resuspend תאים אלה. זה ייתן לך את התערובת של תאים 293T ו MDCK לשמש תרבות שותף שלך.
   • הוסף 250 μl של תאים 293T/MDCK היטב לכל (10-12 יוני, גם בארות).
5. לאחר דגירה RT 20-30 דקות (שלב 1.3), להוסיף 1 מ"ל של DMEM 10% FBS PS 1% לתערובת OptiMEM-DNA-LPF2000 שפעת פלסמיד.
6. מוסיפים 1.3 מ"ל (שלב 1.5) לתוך בארות עם 250 μl של תאים 293T/MDCK (שלב 1.4).
7. נער בעדינות את 6-היטב צלחת ולתת דגירה transfection הלילה (ON) בחממה ב 37 ° C ו 5% CO _2.
8. למחרת, כ 16-24 שעות שלאחר transfection, לשנות את התקשורת ואת transfection דגירה התאים transfected ב BA DMEM 0.3% 1% PS המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של TPCK-טריפסין למשך 48 שעות.
9. לאחר 48 שעות של שינוי התקשורת, העברת supernatant מתאי transfected לתוך צינור microcentrifuge.
10. צנטריפוגה התרבות רקמות supernatant ב microcentrifuge למשך 1-2 דקות, 13,000 סל"ד.
11. להדביק תאים MDCK טרי 6 צלחות היטב (מצופה יום לפני) או 10 יום בן ביצי תרנגולת embryonated עם 200 μl של centrifuged תרבות supernatants רקמה שלב 1.10. דגירה התאים ו / או ביצים על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
    1. זיהום של 10 יום בן ביצי תרנגולת embryonated: כל הנהלים להדביק ביצים עוף embryonated מבוצעים בתנאים סטריליים.
       1. נר 10 יום בת ביצים באמצעות תיבת אור ליקטה את הביצים כדי לראות את הממשק בין שק האוויר חלל allantoic. הפוך את סימן העיפרון על גבול ממשק.
       2. עם מחט מזרק 5 מ"ל לעשות חור קליפת הביצה.
       3. עם מזרק 1 מ"ל, להדביק כל ביצה עם 200 μl של תרבות supernatants רקמה שלב 1.10.
       4. מכסים את החור עם קליפת שעווה מותכת באמצעות מקלון צמר גפן.
       5. לדגור על הביצים נגוע ב 37οC במשך 2-3 ימים.
    2. זיהום של תאים MDCK טרי: יום לפני המעבר בתרבית רקמה supernatant מן 293T/MDCK שיתוף תרבויות קדםלקלף 6-היטב מנות צלחת עם תאים MDCK להגיע מפגש 80-90% למחרת. בדרך כלל, רקמה ומחוברות 100 מ"מ צלחת תרבות ניתן לפצל 6-8 בארות. לשטוף את התאים, פעמיים, עם PBS 1X, trypsinize ולהכין את 6 גם הצלחות. נערו בעדינות ביד צלחות כדי שיהיה הפצה במדים של התאים. התרבות התאים, ON, ב 37 ° C חממה, 5% CO _2. לפני הזיהום, לבדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר monolayer, ואז, להמשיך עם הזיהום:
       • שטפו תאים, פעמיים, עם 1 מ"ל של PBS 1X.
       • להדביק עם 200 μl של supernatants תרבות centrifuged רקמה במשך שעה 1 ב RT. אל תתנו תאים יבש. הסלע 6-היטב צלחת כל 10 דקות.
       • אחרי שעה 1 הקליטה ויראלי, להסיר את המדיה זיהום מתאי MDCK ומוסיפים 2 מ"ל של BA DMEM 0.3% 1% PS המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של TPCK-טריפסין.
       • ב 48-72 שעות לאחר המעבר, בהתאם ליעילות transfection ואת עומס נגיף, השפעה cytopathic (CPE) יהיו שנצפה התאים הנגועים MDCK. CPE מציע הצלה מוצלח. עם זאת, assay HA (סעיף 2) עדיין צריך להתבצע כדי לאשר את קיומו של הנגיף ב supernatants בתרבית רקמה.
12. נוזל קציר allantoic מן הביצים עוף נגוע embryonated: כל הנהלים לקצור את נוזל allantoic מן הביצים נגוע מבוצעים בתנאים סטריליים. כ 8-12 מ"ל של נוזל allantoic ניתן לקצור מביצה 10 יום בן נגוע אחד. לפני קצירת נוזל allantoic, לדגור על הביצים העוף למשך 2 שעות (או) בשעה 4 ° C כדי להרוג את העובר עוף להקריש את הדם.
    • שוטפים את קליפות ביצים עם אתנול 70% להקים בתנאים סטריליים.
    • פתח את הביצה, בזהירות, על חלל האוויר על ידי הקשה בעזרת כף. הסר את קליפת הביצה השבורה בעזרת מלקחיים.
    • עם מחט 1 מ"ל, להסיר את הקרום allantoic בלי לשבור חלמון של ביצה.
    • לייצב את העובר עוף עם מרית כפי שאתה מדריך פיפטה 10 מ"ל לנוזל allantoic. איסוף כמו נוזל allantoic האפשר לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל על קרח בדלי קרח בלי לשבור או איסוף כל חלמון של ביצה. השתמש צינור צנטריפוגה 15 מ"ל כל ביצה.
    • צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להעביר את נוזל allantoic (מבלי לקחת pelleted כדוריות דם אדומות) כדי טרי 15 מבחנות צנטריפוגה מ"ל.
    • חנות צינורות המכיל את נוזל allantoic centrifuged ב 4 מעלות צלזיוס עד שהם נבדקים נוכחות הוירוס הציל עם assay hemagglutination (HA).

2. HA assay כדי לאשר את החילוץ של נגיפי שפעת רקומביננטי

Assay hemagglutination (HA) משמש באופן שגרתי כדי לזהות נוכחות של וירוס שניצלו MDCK תרבות supernatants רקמות ו / או נוזל allantoic ביצים שנקטפו. לחלופין, מבחני immunofluorescence (IFA) ניתן לבצע גם. לאחר assay מזהה נוכחות של וירוס הצילו, הווירוס אמור להיות רובד מטוהרים את ההרכב הגנטי של הנגיף יאושר על ידי RT-PCR וסדר.

נוכחות של הנגיף בתרבות supernatants MDCK רקמות ו / או בנוזל allantoic מן הביצים נגוע ניתן לקבוע macroscopically באמצעות HA של עוף (או מקור אחר) כדוריות הדם האדומות (RBC). נוכחות של הנגיף גורם hemagglutination של RBC תוך היעדר וירוס מאפשר היווצרות של כדורית אדומה בתחתית הבאר (איור 4). במקרה של נגיף השפעת, הוא האמין כי כ -10 ³ -10 ⁴ יחידות פלאק ויוצרים (PFU) נדרשים לתת איתות חיובי assay HA, ולכן IFA יכול להתבצע במקביל assay HA לאשר תוצאה שלילית נכון. IFA עם נוגדנים נגד שפעת העיקרית היא יותר רגישה assay HA כי פחות מ 103-104 וירוסים יכולים להתגלות עם טכניקה זו. זה אפשרי מאשר supernatants או נוזלים allantoic כי הם HA-שלילי הן חיוביות על ידי IFA. במקרה זה, הנגיף צריך להיות מוגבר על ידי passaging, שוב, בתאים MDCK או ביצים. נוזל Allantoic ו / או בתרבית רקמה supernatants מן הקטע השני אמור להיות חיובי מובהק assay HA.

מבחני HA מתבצעות V-96-התחתונה גם הצלחות. שלילית (למשל, PBS 1X) וחיובי (בתרבית רקמה supernatants ו / או נוזל allantoic מזיהום נגיף השפעת) דגימות לשלוט תמיד צריך להיות כלול assay כל HA כדי לאמת אותו.

• לוותר על 50 μl של PBS 1X לבאר כל לתחתית-V-96 גם צלחת.
• הוסף 50 μl שלהתרבות MDCK רקמות supernatants ו / או נוזל allantoic מן הביצים נגוע גם הראשון, לעשות פי 2 דילולים סדרתי עבור בארות הבאה. בטל μl תוספת 50 מבאר האחרון.
• הוסף 50 μl של 0.5% -1.0% כדוריות דם אדומות עוף (שהוכנו PBS 1X) היטב כל אחד.
• דגירה V-96-התחתונה גם צלחת 30-45 דקות (עד נקודה אדומה גלוי בתחתית מדגם שלילי לשלוט PBS) על קרח. קרא interpretate התוצאות כמפורט באיור 4.

3. המעבר של supernatants בתרבית רקמה

תוצאה שלילית assay HA עשוי להיות תוצאה של יעילות transfection נמוך עם רמות נמוכות של הנגיף הנוכחי להיות התרבות supernatants רקמות ו / או נוזל allantoic. המעבר של דגימות אלה ביצים MDCK ו / או embryonated טרי יאפשר הגברה של הנגיף (כמצוין איור 3) זיהומים מבוצעות כפי שתואר לעיל בסעיף 1.11.2.

4. נציג תוצאות

חילוץ מוצלח נגיף השפעת יאושר על ידי נוכחות של assay חיובי HA (איור 4). בנוסף, קיומו של CPE בתאים נגועים עם supernatants בתרבית רקמה או עם הנוזל allantoic מן הביצים תציע הצלה ויראלי חיובית.

באיור 1. מבנה שפעת וירוס: נגיף שפעת מוקף bilayer שומנים המכילה שני גליקופרוטאינים נגיפיים (HA, NA) ו, גם, את החלבון ערוץ יון, M2. HA הוא החלבון מצורף ויראלי, אחראי מחייב sialic חומצה המכילים קולטני. NA הוא האחראי לפרסום ויראלי מתאי המארח. מתחת bilayer שומנים בדם, היא שכבה חלבון מורכב החלבון מטריצה ​​המעטפה הפנימית משטח 1, M1, אשר ממלא תפקיד virion הרכבה ניצני לבין חלבון ייצוא גרעיני (הנא"פ), הנדרשים ליצוא הגרעין של ribonucleocapsids ויראלי. הליבה של הנגיף מורכב ממכלול ribonucleoprotein (RNP), המורכבת 8 גנים חד גדילי שלילי רנ"א נגיפי encapsidated ידי nucleoprotein ויראלי, NP. הקשורים במתחם RNP הם נגיפי RNA-פולימראז תלוי רנ"א יחידות משנה הרשות הפלסטינית, PB1 ו PB2. הלא מבניים חלבונים ns1 PB1 ו-F2, המקודדים על ידי המגזרים RNA ו - NS PB1, בהתאמה, אינם חלק מהמבנה virion.

איור 2. הצלה שפעת פלסמידים וירוס: נגיף שפעת שמונה גנים משובטים לתוך pDZ ambisense פלסמיד מצוינים. pDZ פלסמיד ^6, נגזר הביטוי חלבון פלסמיד pCAGGs ^7, הוא וקטור פלסמיד כיוונית עם פולימראז RNA אנושי אני היזם רצף שליחות קטלנית עכבר המקודד רנ"א גנומי תחושה שלילית; בכיוון ההפוך פולימראז אני להתאחד, פולימראז II קלטת שעתוק (β-אקטין עוף היזם פולה) המקודד את חלבונים נגיפיים מן הגן ויראלי אותו. cDNAs של כל פלח ויראלי מופקים על ידי RT-PCR עם פריימרים קדימה הפוכה המכיל את endonuclease הגבלה SAPI האתר האזורים noncoding של כל פלח (קופסאות שחורות בסוף הגנים נגיפי). מוצר ה-PCR משובטים לתוך pDZ מעוכל עם SAP-I.

איור 3. שמונה פלסמיד מבוססי מערכת הצלה שפעת: pDZ פלסמידים המכילים את הגנים של נגיפי שפעת 8 הם שיתוף transfected, ההשעיה, ב-293T MDCK תאים שיתוף תרבויות (יום 1). עשרים וארבע שעות שלאחר transfection, מדיה ללא FBS אבל המכיל TPCK / טריפסין מוחלף (יום 2). ארבעים ושמונה שעות לאחר שינוי התקשורת, התרבות supernatant רקמות שנקטפו ומשומשים להדביק MDCK או 10 יום בן ביצי תרנגולת embryonated (יום 4). 48-72 שעות לאחר הגברה, תרביות רקמה של תאים נגועים supernatants MDCK או נוזל allantoic מן הביצים נקצרים ו assayed עבור נוכחות של הנגיף על ידי HA (יום 6). אם לא זוהה הנגיף, supernatants אותו ו / או נוזלים allantoic ניתן מחדש passaged לתאי MDCK טריים ו / או ביצים embryonated.

איור 4. Hemagglutinin assay (HA): hemagglutination של RBC על ידי חלקיק וירוס גלוי macroscopically והוא הבסיס לזהות חלקיקים נגיפיים בתרבות supernatants רקמות ו / או נוזלים allantoic. למרות assay HA אינה מפלה בין חלקיקים נגיפיים, כי הם זיהומיות חלקיקים מפורקים שאינו מסוגל עוד להדביק תאים, assay הוא אינדיקטור טוב של נוכחות של הנגיף בדגימות. א) היעדרות (למעלה) של נוכחות (התחתון) של הנגיף בדגימות ביולוגיות נקבע על ידי נוכחות של RBC בתחתית הצלחת או היעדרם, respectively. ב) תוצאה נציג assay HA ללא רמות לגילוי של וירוס (למעלה) או נוכחות (התחתון) של הנגיף מוצג.

Discussion

ההצלה של נגיפי שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד הוא תהליך פשוט וברור פעם פרוטוקול מבוצע באופן שגרתי במעבדה, אבל בהתחלה, דברים רבים יכולים להשתבש. זה הכרחי להיות הכנה טובה פלסמיד כדי ליצור את הנגיף. תחזוקה נכונה של שורות תאים (293T ו MDCK) הוא חיוני להצלת ויראלי מוצלח. באופן מסורתי, תג גנטי מוחדר שפעת הגן קידוד פלסמיד, על ידי mutagenesis שקט. מבוא של מוטציה זו שותק (ים) ויצירת, למשל, הגבלה רומן אתר אנזים המשמש להבחין בין wild-type ו - וירוס השפעת רקומביננטי על ידי אנזים העיכול. לכן, לאחר הגברה של השלט מטוהרים וירוס רקומביננטי, RT-PCR וסדר גישות יש לבצע כדי לוודא את אופי הווירוס ניצל. הפיתוח של טכניקות אלה הפוכה גנטיקה הצלה מוצלחת של נגיפי שפעת רקומביננטי מ פלסמידים יאפשר לך לענות על שאלות ספציפיות על הביולוגיה של הנגיף.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995-065	Store at 4°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	Store at 4°C
TPCK-trypsin	Sigma-Aldrich	T-8802	Store at -20°C
Bovine Albumin (BA)	Sigma-Aldrich	A7979	Store at 4°C
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X	Invitrogen	15140-122	Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates	Nalge Nunc international	249570
Embryonated chicken eggs Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures. Chicken red blood cells (RBC) Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC). Tissue culture supernatants and allantoic fluids Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C. Plasmids All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2. Viruses The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.