Summary
ويمكن تقدير معدل الدوران من الفيروسات في الأنظمة البحرية والمياه العذبة عن طريق الحد من تكرار وتقنية. البيانات تسمح للباحثين لاستنتاج معدلات وفيات فيروس الميكروبية التي تتوسط في النظم المائية.
Abstract
الفيروسات انتشارا هي مكونات النظم البحرية والمياه العذبة ، والمعروف أن وكلاء كبيرة من وفيات الميكروبية. وضع تقديرات كمية لهذه العملية أمر بالغ الأهمية لأننا يمكن أن تتطور ثم نماذج أفضل لهيكل المجتمع الميكروبية وظيفة فضلا عن تعميق فهمنا لكيفية عمل الفيروسات لتغيير دورات البيوجيوكيميائية المائية. تقنية تخفيض الفيروس يسمح للباحثين لتقدير السعر الذي يتم الافراج جزيئات الفيروس من المجتمع الميكروبية المتوطنة. باختصار ، هو انخفاض وفرة من الفيروسات (خارج الخلية) في عينة مجانية بينما يتم الحفاظ على تركيز المجتمع الميكروبية في المحيط القريب. ومن ثم حضنت المجتمع الميكروبية في غياب الفيروسات مجانا والمعدل الذي فيروسات تتكرر في العينة (من خلال تحلل أعضاء المصابة بالفعل للمجتمع) يمكن قياسها كميا بواسطة المجهر epifluorescence أو ، في حالة من فيروسات محددة ، والكمية PCR. ويمكن عندئذ أن تستخدم هذه المعدلات لتقدير معدل وفيات نتيجة لتحلل الميكروبي خلية الفيروس بوساطة.
Protocol
1. الفائق من مياه البحر لتوليد "خالية من الفيروسات" المياه (ويلهلم Poorvin 2001)
- يتم جمعها من مياه البحر حوالي 20L / lakewater كما جو معقم و مطهر ممكن.
- غير متسلسل prefiltered المياه من خلال 142 ملم قطرها 0.8 البولي مرشحات ميكرومتر التي يمكن الاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية لتحليل المجتمع. ويمكن استخدام مرشحات أكبر حجم المسام قبل هذه الخطوة لأنظمة مثمرة للغاية.
- للحصول على المياه ultrafiltered من نظام M12 Amicon (ميليبور) يستخدم لمدة 30 خرطوشة دوامة كيلو دالتون ، قطع لاستبعاد كل الفيروسات ، وحتى الصغيرة فيروسات الحمض النووي الريبي.
- تتم معالجة العينات وتتركز في سرعة ~ 25 ٪ مع باسكال 15-16 ~ من الضغط الخلفي.
- وسوف تبقى من العينة 500 مل من الماء ~ تحتوي على الفيروس يتركز المجتمع (والتي يمكن حفظها لتجارب أخرى) ، في حين سيتم استخدام ما تبقى من 19.5 لتر من المياه للفيروسات مجانا للفحوصات الإنتاج الفيروسية.
- بعد كل يوم من الاستخدام ، يجب تنظيف M12 Amicon نظام لمنع تلف الغشاء من خرطوشة فلتر.
- إذا كنت تعمل مع مياه البحر ، وشطف الغشاء بها مع ما لا يقل عن 6L من الملة - Q المياه يليه الغسيل بمحلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1N عن 30-45 دقيقة.
- شطف مرة أخرى مع خرطوشة على الأقل من الملة 6L - Q المياه.
- عند الانتهاء من استخدام نظام M12 ، ينبغي تخزين خرطوشة في دوامة 0.05MH 3 ص 4 حل في 4 درجات مئوية.
2. فيروس أسلوب الحد لإنتاج الفيروسي (فيلهلم وآخرون 2002)
- يصل الى 500 مل من العينة مياه البحر / lakewater مع الحصول على كل من الدول المضيفة والفيروسات وضعت في وحدة sterifilter مع انخفاض 0.2 ميكرومتر مسام الحجم الاسمي البروتين الملزمة تصفية (على سبيل المثال ، Durapore) الملقاة على عاتقها.
- وبلطف ضغط على فراغ العينة 200 مم زئبق <إعادة التعليق في حين باستمرار العينة باستخدام ماصة معقمة لمنع نقل خلايا بكتيرية من التركيز على تصفية.
- ببطء تضاف ثلاثة مجلدات من رشاحة مستدقة إلى تعليق البكتيرية لخفض كبير في عدد الفيروسات مجانا في العينة.
- وتضعف البكتيريا مرة أخرى إلى كسر 500 مليلتر من الماء للفيروس مجانا ، وتنقسم إلى ثلاثة مكررات من كل 150 مل وتوضع في زجاجات البولي واضحة 250ml.
3. تدفق الترشيح عرضية (TFF) طريقة لإنتاج الفيروسي (Weinbauer وآخرون 2002 ، Winget وآخرون ، 2005)
TFF يمثل نهجا بديلا لأسلوب الحد الفيروسية.
- ويتم جمع ما يقرب من 500 مليلتر من العينة الطبيعية على النحو المبين أعلاه.
- وتتركز هذه العينة باستخدام 0.2 ميكرومتر الاسمية مسام حجم تدفق الترشيح عرضية النظام.
- عندما يتم تقليل نسبة البكتيريا إلى حوالي 10-15 مل ، يضاف ultrafiltered ، خالية من الفيروسات المياه وتوزيعها على النحو الوارد أعلاه.
- يتم تحضين الزجاجات تكرار في الوضع الطبيعي في ظل ظروف استخدام غرف البيئية.
- يتم تغيير مستويات الضوء على ظروف السطح باستخدام زرقاء ملون الاكريليك الاكريليك أو الفرز واضحة مع انخفاض صافي شدة الضوء.
- غالبا ما يتم الحصول على درجات حرارة سطح المحيط باستخدام مياه البحر تتدفق على سطح السفينة الحاضنة.
- وتؤخذ عينات لتقديرات وفرة البكتيرية والفيروسية في وقت 0 مع التركيز النهائي للغلوتارالدهيد العقيمة 2،0-2،5 ٪ تضاف الى cryovials. وعلى الفور هذه العينات فلاش المجمدة مع النيتروجين السائل وتخزينها مجمدة حتى معالجتها.
- اذا النيتروجين السائل لا يتوفر ، قد تكون على استعداد الشرائح المجهرية ومعالجتها فورا (انظر الإجراء أدناه)
- يتم جمع العينات الفرعية كل ساعة 2.5 لا يقل عن 10 ساعة من الطريقة الموصوفة أعلاه.
- ربما في هذا الوقت يتم جمع المياه للتحليل PCR الكمي. ويمكن إضافة ما يصل إلى 5 مل من العينة إلى cryovial مع عدم وجود وكيل مثبت مع فلاش تجميد فوري في النيتروجين السائل.
4. الفيروسية الميكروسكوب الإنتاج (وFuhrman نوبل عام 1998 ، ون جيا باو وآخرون 2004)
- يجب إذابة العينات المجمدة لتكون 0.02 ميكرون ، تصفية للفحص المجهري على الجليد.
- يعد حل الأسهم الخضراء SYBR بواسطة تمييع الحل 1:10 الأسهم مع الماء المعقم. القادم من الحل الأوراق المالية ، وتعد حلا العمل بإضافة 1mL من محلول المخزون إلى 39 مل من الماء المعقم. وينبغي أيضا الجلسرين 50 ٪ ، 50 ٪ فوسفات مخزنة حلول المالحة (PBS ، 0.05 م 2 نا هبو 4 ، 0.85 ٪ كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5) والحل الطازجة 2.5 ٪ من الأسهم ف phenylenediamine يكون مستعدا قبل بداية. الحفاظ على 50 ٪ حل PBS glycerol/50 ٪ في 4 درجات مئوية وphenylenediam - Pالمعهد الوطني للإحصاء المخزون في -20 درجة مئوية في الظلام حتى تبدأ. الحق قبل التصفية إضافة ف phenylenediamine إلى 50 ٪ PBS glycerol/50 ٪ لتركيز النهائي من 0.1 ٪ لاستخدامه كحل Antifade.
- وضع 25 مم 0.02 ميكرون تصفية - Anodisc على رأس MicronStep - 0.45 ميكرون ، السليلوزية دعم مرشح. إضافة 850 ميليلتر من العينة ثابتة لأعلى Anodisc وفراغ في 20 الباكاف الحمضية حتى جفت تماما. مكان 100 ميكرولتر من محلول أخضر SYBR تعمل على طبق بتري معقمة و، مع فراغ لا يزال على إزالة بعناية Anodisc من برج تصفية ومكان على SYBR الخضراء. احتضان هذه العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. إزالة بعناية مرشح من حل الخضراء SYBR الفتيل والجزء الخلفي من التصفية مع Kimwipe لإزالة كافة صبغ المتبقية. إذا رغبت في ذلك ، العودة إلى تصفية البرج وتمرير ما يصل الى 800 ميكرولتر من 0.02 ميكرون ، الماء المصفى أو وسائل الإعلام معقمة من خلال تصفية وصمة عار لشطف الزائدة.
- إضافة قطرة صغيرة من محلول antifade على شريحة المجهر ووضع غطاء على رأس زلة. إزالة الغطاء زلة وإضافة إلى تصفية المجفف الشريحة المجهر مبللة بمحلول antifade. مرة أخرى ، إضافة كمية صغيرة من محلول antifade زلة لتغطية ومكان ببطء على أعلى من مرشح ، مع التأكد من التخلص من أي الفقاعات التي قد تشكل.
- تجمد على الفور الشرائح في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها (وينبغي أن تستخدم هذه في غضون بضعة أشهر لمنع وخفض التهم يتلاشى الفيروس)
- وترد الفيروسات باستخدام المجهر مضان (في حالتنا المجهر DMRXA ايكا) مع مجموعة واسعة تصفية الأزرق (λ = تحويلة 450-490 نانومتر ، λ = 510 نانومتر إم مع مرشح في قمع λ = 510 نانومتر). سيقوم كل مرشح على الأقل 20 حقول نظر عدها ، والتأكد من أن كمية الفيروسات من مجموع كل شبكة الميدانية لضمان توزيع عادل للفيروسات عبر غشاء التصفية.
- وبلغ متوسط معدلات من تكرار الفيروس من المستقلين three متماثلة ومن ثم تحسب ويتم تحديد الانحراف المعياري من معدلات الإنتاج.
5. ممثل النتائج
البيانات الأولية التي جمعها الباحث يتطلب الحد الأدنى من المعالجة الحسابية لتوليد معدلات تكرار وفرة الفيروس. مجموعة البيانات الأولية الناتجة عن هذه الدراسة هي معدلات تكرار وفرة الفيروس في العينات الفرعية من حضانات. هذه النتائج شكل انحدارات مستقلة وفرة الوقت ضد الفيروسات لكل من العينات. لكل عينة حضانات الفردية بمثابة علاج واحد ، حتى قبل إنجاز ثلاث نسخ ، الباحث حضانات يمكن حساب معدلات وكذلك تقدير الاختلاف (على سبيل المثال ، الانحراف المعياري) (انظر الشكل 1).
التحذير واحدة من هذه العملية هو أن الحد من وفرة في الثوابت الفيروس يؤدي إلى انخفاض في الخلايا المضيفة في العينة التي تحمل عبء الفيروس. للتعويض عن هذه الخسارة ، والعد من وفرة من مصدر البكتيريا على السواء (فلتر مياه البحر أو مياه البحيرة) و= T عينة حضانة 0 ضرورية. ويمكن استخدام هذه المعلومات لحساب النسبة المئوية من الخلايا المفقودة : على افتراض أن عملية الحد من وفرة الفيروس ليس انتقائيا لصالح أو ضد أي من أفراد المجتمع الجرثومية ، ويمكن بعد ذلك أن هذا العامل يمكن استخدامها لتقدير معدل الإنتاج في الموقع من الفيروسات .
الشكل 1. وقد تم جمع عينات من إنتاج الفيروسات مثل الجزيئات على مدى 10 ساعة في الحضانة في ظروف الموقع باستخدام المجهر epifluorescence. العوالق النباتية خلال ازهر قبالة سواحل نيوزيلندا في شهر سبتمبر من عام 2008.
الشكل 2. رسم تخطيطي للعملية تدفق العمل لمعايرة الانتاج الفيروس. تبدأ العملية مع الفائق عينة من المياه لتوليد المياه خالية من الفيروسات. اكتمال هذا باستخدام نظام الترشيح الفائق. في عينات المياه موازية يتم جمعها من نفس الموقع والفيروسات حرة مرت من خلال مرشح في حين يتم الاحتفاظ المجتمع الميكروبية (التي تحتوي على خليط من الخلايا المصابة وغير المصابة). هو معلق ثم هذا المجتمع في الماء فيروس مجانا وحضنت تحت ظروف الموقع. ثم يتم رصد معدل تكرار الفيروسات للساعات ال 10 المقبلة لتحديد معدلات إنتاج الفيروس.
Discussion
وثمة عنصر حاسم في فهم كيفية تأثير الفيروسات المجتمعات الميكروبية البحرية لتحديد المعدل الذي يتم إنتاج جسيمات الفيروس. بالنظر إلى أن الكميات المتوفرة هي (أكثر أو أقل) ثابتة في معظم أنظمة (ويلهلم Suttle 1999 ، Weinbauer 2004) ، وتتم إزالة تلك الفيروسات أو جعلها غير المعدية بسرعة في النظم المائية (ويلهلم وآخرون 1998) ، ثم يجب أن تكون معدلات الإنتاج النسبية السريع ليحل محل جزيئات المفقودة.
تقدير معدل وفيات الفيروسات تتسبب في المجتمع الميكروبية يتطلب معرفة كيفية العديد من الفيروسات يتم إنتاجها في كل مرة فيروس lyses خلية ("حجم الانفجار"). يمكن أن تنفجر أحجام الفيروس في عينات طبيعية تختلف إلى حد كبير. ويمكن تحديد أحجام انفجر مباشرة انتقال المجهر الإلكتروني (على سبيل المثال ، وWeinbauer Peduzzi 1994) ، ولكن هذا غالبا ما يتجاوز قدرات مختبر معين ، أو ليست دائما عملية. في الحالات التي لا يمكن تحديدها تجريبيا ، يمكن استخدام قيم الأدب من 24 فيروسات في حال lytic للأنظمة البحرية و 34 لنظم المياه العذبة (بارادا وآخرون 2006). إذا تم تقسيم معدل إنتاج الفيروس عن طريق هذا الرقم ، والنتيجة هي وفرة من الخلايا لكل وحدة التخزين التي دمرتها الفيروسات على أساس يومي. ثم يمكن لهذه الميكروبات lysed تكون القيمة مقسوما على وفرة المخزون يقف الجرثومي مما أسفر عن وفيات الفيروس الناجم عن النظام في السؤال : تتراوح التقديرات الحالية في المئة من عدد قليل من السكان تقريبا كامل وغالبا ما تعتمد على عوامل أخرى في النظام في السؤال (ويلهلم وماتيسون 2008). لتحديد النسبة المئوية من مجموع الوفيات في كثير من الأحيان يتم ضرب هذا الرقم من قبل اثنين من (العمل من افتراض أن 50 ٪ من الخلايا تستمر في التكاثر ويتم فقدان 50 ٪ من الخلايا ، Weinbauer 2004).
نظرا إلى أن المواد الغذائية وتتبع عنصر التوافر البيولوجي (على سبيل المثال ، N ، P ، الحديد) يمكن أن يحد من معدل الإنتاجية الأولية ، وكما تدفق الكربون من هذا القبيل ، من خلال النظم المائية ، وفهم دور وفيات فيروس يحركها الميكروبية في هذه العملية أصبحت تهم geochemists البحرية. وتوجد حاليا عدة تقديرات تشير إلى أن الفيروسات الافراج عن تركيزات كبيرة من العناصر الغذائية مرة أخرى إلى عمود الماء على أساس يومي (رو وآخرون 2008 ، هيغنز وآخرون 2009) والتي يتم استيعابها بسرعة هذه العناصر من قبل المجتمع الجرثومية (Poorvin وآخرون بن ، 2004 ، Mioni وآخرون 2005). ويمكن تحديد نسبة تدفق المواد الغذائية على البيئة عن طريق ضرب عدد الخلايا التي دمرها كمية من الخلايا في المغذيات (الرمز "الحصص"). ويمكن تقديم هذه المعلومات عنصرا حاسما في فهمنا للكيفية التي تعمل في شبكات الغذاء الجرثومية عبر النظم المائية.
التطورات الجارية : الجهود الحالية لسلسلة من المجموعات البحثية تشمل التكيف مع الاستراتيجية المذكورة أعلاه لتعداد فيروسات محددة داخل المجتمع ، وعلى هذا النحو ، لتحديد كيفية تأثر الكائنات محددة من نشاط الفيروس. للقيام بذلك استخدم الباحثون سلسلة البلمرة الكمية التفاعل (qPCR) لتقدير وفرة من الجماعات فيروسات محددة أو الأسر في موازية لتقديرات المجتمع فيروس الكلي. ثم يتم تطبيق نتائج مباشرة لتقديم تقديرات لمعدل وفيات الفيروس ، ودوران المغذيات ، الخ العوالق للجماعات معينة. وهذا النهج قوية جديدة تسمح للباحثين في السنوات المقبلة لحفر أعمق بكثير في العمليات المرتبطة الفيروسات والايكولوجيا ، للمرة الأولى ، لقياس التفاعلات بين المجتمعات المضيفة للفيروسات محددة وراء القيود التي تفرضها النظم المختبرية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد نشر هذا المقال عن طريق منحة من مكتب البحوث في جامعة ولاية تينيسي. المؤلفان بالشكر إلى الجيل السابق من الطلاب والباحثين التي عملت على صقل هذه الإجراءات. وأيد البحوث من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF - 0851113 ، 0825405 ، وجبهة الخلاص الوطني ، جبهة الخلاص الوطني 0550485).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
- Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean. Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).
- Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter. Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems. J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).
- Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton. Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 Forthcoming.
- Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic. Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).
- Weinbauer, M. G.
- Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes. Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).
- Weinbauer, M. G., Winter, C., Hö, fle, G, M. Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities. Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).
- Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).
- Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters. Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).
- Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences. Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).
- Wilhelm, S. W., Poorvin, L. Quantification of algal viruses in marine samples. Paul, J. H. , Academic Press. London, UK. 53-66 (2001).
- Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. Viruses and nutrient cycles in the sea. Bioscience. 49, 781-788 (1999).
- Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea. Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).
- Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production. Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).
