Summary
Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt in
Abstract
Het protocol hier gepresenteerde is ontworpen om de activering van de grote geleiding, spanning-en Ca 2 +-geactiveerde K + (BK) kanalen te bestuderen. Het protocol kan ook worden gebruikt om de structuur-functie relatie van andere ionkanalen en neurotransmitter-receptoren een studie. BK-kanalen worden op grote schaal, uitgedrukt in verschillende weefsels en zijn betrokken bij tal van fysiologische functies, inclusief de regulering van gladde spiercontractie, frequentie tuning van binnenste haarcellen en de regulatie van neurotransmitters 2-6. BK kanalen worden geactiveerd door membraan depolarisatie en door intracellulaire Ca 2 + en Mg 2 + 6-9. Daarom is het protocol ontworpen om zowel het membraan spanning en het intracellulaire oplossing te controleren. In dit protocol wordt boodschapper-RNA van de BK-kanalen geïnjecteerd in Xenopus laevis oöcyten (fase V-VI), gevolgd door 2-5 dagen incubatie bij 18 ° C 10-13. Membraan patches die een of meerdere BK kanalen bevatten, zijn uitgesneden met de 'inside-out configuratie met behulp van patch-clamp technieken 10-13. De intracellulaire kant van de pleister is geperfuseerd met gewenste oplossingen tijdens de opname, zodat het kanaal activatie onder verschillende omstandigheden kunnen worden onderzocht. Samen te vatten, is het mRNA van BK-kanalen geïnjecteerd in Xenopus laevis oöcyten op kanaal eiwitten te uiten over de eicel membraan; patch clamp technieken worden gebruikt om de stromen door de kanalen onder gecontroleerde spanning en intracellulaire oplossingen op te nemen.
Protocol
1. Injectie van mRNA in Eicellen
- Injecteer 0,05 tot 50 ng boodschapper-RNA, dat was in vitro overgeschreven in Xenopus laevis oöcyten (fase V-VI) met behulp van Nanoject II Auto-Injector nanoliter (Drummond Scientific Company, model 3-000-204). Herhaal de injectie op een tiental eicellen voor elke mRNA.
- Spoel de geïnjecteerde eicellen twee keer met behulp van ND-96 oplossing (96 mM natriumchloride (NaCl, de heer 58,44 g / mol), 2 mM kaliumchloride (KCl, de heer 74,56 g / mol), 1,8 mM calciumchloride (CaCl 2 • 2H 2 O , de heer 147,02), 1 mM magnesiumchloride (MgCl 2 • 6H 2 O, de heer 203,31 g / mol), 5 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, de heer 238,31 g / mol), 2,5 mM natriumpyruvaat (de heer 110,04 g / mol), en 1x penicilline-streptomycine. pH 7,6), en plaats ze in een cultuur plaat en incubeer bij 18 ° C gedurende 2 + dag.
2. De voorbereiding van de perfusie-systeem
Illustratie van de Automatiseer ValveLink 16 perfusie-systeem. Het systeem maakt gebruik van perfusie druk stikstof aan bloedtransfusie-oplossingen duwen van de oplossing reservoirs, door de perfusieslangen, en om de perfusie potlood en fooi. De stroom van elke stroom van perfusie-oplossing wordt gecontroleerd door een reservoir klep en een elektronische klep. In dit protocol, een van de reservoirs is niet onder druk en fungeert als een ophaler en een druk-release mechanisme. (Foto overgenomen uit de website van de leverancier van http://www.autom8.com)
- Sluit de leidingen naar de perfusie potlood. Zet op de elektronische afsluiterbesturing en open de elektronische kleppen.
- Om te verzekeren dat de leidingen en de perfusie potlood zijn vrij van verstoppen en luchtbellen, push gedeïoniseerd (DI) water door elke slang met behulp van een injectiespuit gevuld met gedemineraliseerd water.
- Sluit de leidingen aan de oplossing reservoirs en open de kraan van de gasfles naar onder druk stikstof toe te passen.
- Open het reservoir klep om de slang te vullen met reservoir oplossing. Flick het reservoir zodat de bellen te verwijderen in de oplossing als dat nodig is. Sluit de klep nadat de slang is gevuld met de oplossing.
- Vul de perfusie tip met water en schroef deze op de perfusie potlood. Wees voorzichtig dat er geen luchtbellen val bij het aansluiten van de tip.
- Bevestig de perfusie potlood om het bad podium met behulp van boetseerklei. Zorg ervoor dat de perfusie tip is in het bad ruimte. De perfusie-systeem is nu ingesteld.
- Voeg DI water in het bad. Zorg ervoor dat de doorbloeding tip is ondergedompeld in het water.
- Test dat elke perfusie oplossing komt op de juiste wijze van de perfusie tip. Sluit de elektronische kraan aangesloten op de buizen van afvalinzamelaar en open de afsluiter voor een perfusie-oplossing in een tijd (140 mM kaliumhydroxide (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl) -1 - piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM kaliumchloride (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM Ethyleen glycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetra-azijnzuur (EGTA, M r 380,35 g / mol), wordt de pH ingesteld op 7.1-7.2 door methaansulfonzuur (meso 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 + of Mg 2 + wordt toegevoegd om de gewenste concentratie als dat nodig is). Onder de microscoop, houden aan de straal van de perfusie vloeistof die uit de perfusie tip. Sluit de klep voor perfusie-oplossing en open de klep voor de afvalinzamelaar. De perfusie straal moet bijna verdwijnen. Herhaal dezelfde test voor alle bloedtransfusie-oplossingen.
- Wanneer u dat alle bloedtransfusie-oplossingen stroom goed gecontroleerd, vervangen DI water in het bad met een bad-oplossing (140 mM kaliumhydroxide (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM kaliumchloride (KCl, M r 74,56 g / mol), wordt de pH ingesteld op 7.1-7.2 door methaansulfonzuur (meso 3, M r 96,1 g / mol)).
3. Patch Spannen
- Overschildertijd de Ag opname elektrode met AgCl voor elke patch klemmen sessie. Verwijder eerst de elektrode draad van de pipet houder en dompel de punt de helft van de elektrode draad in een flacon met verse bleekwater gedurende tenminste 15 minuten. Deze deposito's een laagje AgCl op de draad.
- Spoel de elektrode draad met gedeïoniseerd water en dep droog. Vervolgens installeert u de Ag / AgCl elektrode in de pipet houder.
- Sluit het bad (referentie) elektrode naar de headstage en plaats het in het bad. Dit bereidt de elektroden voor opname.
- Nu voor te bereiden op data-acquisitie. Zet de computer aan en steek de hardware sleutel in de printer-poort van uw computer. De hardware sleutel moet worden aangesloten voor u om de data-acquisitie software, die is HEKA puls te gebruiken.
- Schakelaar op de versterker (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) en start HEKA Pulse. Laad het protocol bestand en pas de configuratie-instellingen, zoals de Stimulus Scale. Het doel voor het aanpassen van de configuratie-instellingen is om te verzekeren dat de test potentieel is precies gelijk aan het commando potentieel. Dit bereidt de data-acquisitie apparatuur.
- Bereid eicellen. Dompel de eicel in stripoplossing (200 mM N-Methyl-D-glucamine (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM Aspartaat (geen K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM kaliumchloride (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM Ethyleen glycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetra-azijnzuur (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM magnesiumchloride (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, M r 238,31 g / mol), wordt de pH ingesteld op 7,4 door natriumhydroxide (NaOH, M r 40,0 g / mol) gedurende 5 - 10. min De stripoplossing los van de vitelline membraan van de plasmamembraan die het mogelijk maakt om strip de vitelline membraan.
- Voorzichtig strip de vitelline membraan van de eicel gebruik van twee paar pincetten. Een devitellinized eicel is uiterst fragiel en moeten daarom worden verplaatst zo weinig als dat nodig is.
- De zorg om te voorkomen dat het blootstellen van de devitellinized eicel aan lucht of bellen, gebruik dan een glazen pipet gevuld met voldoende oplossing om de eicel te dragen aan het bad. Dit bereidt de eicel voor opname.
- Bereid patch pipetten. Trek de glazen pipetten na het plaatsen van een glazen capillaire buis (VWR International, Cat # 53,432 tot 921) in een Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipet Puller. Neem de pipetten onder de microscoop naar de tip vorm en opening met een diameter te bepalen. De opening met een diameter moet worden 2-4 micrometer.
- Om capacitieve stroom te verminderen tijdens het opnemen en een soepele tip, de vacht van de tip met was te verzekeren en vervolgens brand-polijsten.
- Vul de pipet tip door de punt van de pipet in de pipet-oplossing (140 mM kaliumhydroxide (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM kaliumchloride (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM magnesiumchloride (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), wordt de pH ingesteld op 7.1-7.2 door methaansulfonzuur zuur (meso 3, M r 96,1 g / mol)) en het trekken van de zuiger. Dit nat van de tip.
- Vul pipet 1 / 3 vol met pipet oplossing met behulp van een injectiespuit en plaats de pipet in de pipet houder met de Ag / AgCl elektrode in en contact met de pipet oplossing. Dit bereidt de patch pipet.
- Aan accijnzen een inside-out patch uit de voorbereide eicel, vinden de duidelijke rand van de eicel onder de microscoop. Verplaats de patch pipet de buurt van de eicel met behulp van manipulator. Noteer het serienummer weerstand van de pipet. De ideale serie weerstand van de patch pipet is tussen 1-1,5 MΩ bij gevuld met pipet oplossing en ondergedompeld in bad oplossing.
- Langzaam duw de pipet tegen de eicel tot aan de weerstand van ongeveer verdubbelt.
- Zachtjes zuigkracht aan het membraan via de mond door middel van een zuig-buis die is verbonden met de pipet houder tot een giga-ohm afdichting wordt verkregen. Het stabiliseren van de patch en houd het op spanning -30 mV voor een paar minuten.
- Voor het verkrijgen van een inside-out patch, accijnzen de patch door snel druk op de pipet verder in de eicel en vervolgens voorzichtig naar buiten te trekken.
- De inside-out patch is nu klaar voor het vastzetten. Verplaats de pipet die de inside-out patch tot ongeveer 100 micron uit de buurt van de opening van de perfusie tip.
- Sluit de klep voor elektronisch afval verzamelen en open de klep reservoir voor de gewenste perfusie-oplossing
- Beginnen met het opnemen stromingen over de patch. Verander de spanning en perfusie-oplossingen zoals gewenst.
- Wanneer u klaar bent met opnemen, het reinigen van de perfusieslangen, potlood en tip door te drukken door middel van gedeïoniseerd water om klompen te voorkomen.
4. Representatieve resultaten
Tijdens de voorbereiding van eicellen voor patch clamp, de 5-10 minuten behandeling van strippen oplossing zou het vitelline membraan los te maken van de plasma membraan, die het mogelijk maakt het strippen van de vitelline membraan.
De ideale serie weerstand van de patch pipet is tussen 1-1,5 MΩ bij gevuld met pipet oplossing en ondergedompeld in bad oplossing.
Hieronder vindt u een representatief opname van wild-type BK kanalen op een eicel membraan patch. Aan de linkerkant boven, de vierkante golven geven de spanning op de patch - de tweede stap van de spanning neemt toe van 50 mV tot 200 mV met een toename van 50 mV. Hieronder vindt u de bijbehorende stroom sporen als de perfusie-oplossing nominale 0 Ca 2 + (gratis [Ca 2 +] is ongeveer 0,5 nM) heeft. Het inplooi van de huidige amplitude geeft aan dat de open kans op BK kanalen neemt toe met de spanning. Aan de rechterkant, is dezelfde pleister geperfuseerd met 1,0 uM Ca 2 + bij toepassing met dezelfde spanning protocol. De huidige amplitude neemt meer onder dezelfde spanning, wat aangeeft dat de open kans neemt toe met de [Ca 2 +]. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eicel uitdrukking systeem is ideaal voor elektrofysiologische karakterisatie van voltage-afhankelijke ionkanalen wegens het relatief lage achtergrond van endogene kanalen. Bovendien, omdat het een transiënte expressie systeem, biedt een efficiënte methode voor het uitvoeren van mutagenese studie van deze kanalen. Toch moet worden opgemerkt dat de eicel expressie systeem verschilt van die in zoogdiercellen, waardoor er verschillen kunnen zijn in de post-translationele modificatie en vereniging met verschillende subeenheden. Bovendien kan de lipide concentratie verschillen tussen de twee cellen die van invloed kunnen zijn van het kanaal functionele eigenschappen.
De perfusieslangen, potlood en tip moet worden gereinigd met DI-water elke keer na het experiment om verstoppen te voorkomen. Gebruik altijd verse bleekmiddel om de Ag elektrode draad te behandelen om er zeker van is gecoat met AgCl anders, zal de opname onnauwkeurig zijn. Pas de configuratie-instellingen voor data-acquisitie, zodat de test potentieel is precies gelijk aan het commando potentieel. Het zou nuttig zijn om de patch pipetten schoon, zodat een deksel te gebruiken om hen te beschermen tegen vuil en ze brand-polish alleen voor gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health beurzen R01-R01-HL70393 en NS060706 naar JCJC is een hoogleraar Biomedische Technologie aan de Spencer T. Olin Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | CKX31 | |
| Glass Pipettes | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
