우리는 형성을위한 간단하고 신속하고 강력한 방법을 설명 캔디다 albicans biofilms.
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방법 논문
모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms
이 논문에서
요약
초록
캔디다 albicans 지금은 미국 병원에서 세 번째로 가장 일반적인 감염 위험 환자와 칸디다 증의 확대 인구의 곰팡이 감염의 가장 빈번한 원인 남아있다. 칸디다 증의 발현은 다른 호스트 조직 및 / 또는 의료 기기 (즉 카테터)에 두 biofilm 형성과 관련이 있습니다. biofilms 내에서 세포가 면역 반응 호스트로부터 antifungals의 행동으로부터 보호되면서 Biofilm 형성은 부정적인 임상 영향을 수행합니다. 우리는 C. 형성을위한 간단하고 신속하고 강력한에서 체외 모델을 개발 또한 biofilm antifungal 자화율 시험에 사용할 수있는 96 잘 microtiter - 접시를 사용 albicans의 biofilms. 이 분석의 판독은 metabolically 활성 곰팡이 biofilm 세포에 의해 XTT의 감소 (tetrazolium 소금)을 기반으로, colorimetric입니다. 전형적인 실험은 antifungal 자화율 시험에 대한 추가 24 H와 biofilm 형성에 대한 약 24 H 걸립니다. 때문에 단순하고 일반적으로 사용 가능한 실험실 재료 및 장비의 사용이 기술은 biofilm 조사를 democratizes 및 곰팡이 biofilms의 antifungal 자화율 테스트 표준화 향한 중요한 단계를 나타냅니다.
프로토콜
1. C.의 준비 albicans
C. albicans는 위험 그룹 1/BSL1 미생물입니다. 항상이 미생물과 함께 일을 잘 무균 / 살균 기술을 사용하여 생물 학적 물질의 적절한 처리를위한 제도적 절차를 따르도록 기억 해요.
- C.의 야간 문화를 준비 C.의 단일 식민지 inoculating하여 YPD (효모 펩톤 덱스 트로 오스) 액체 매체 albicans YPD 25 ML에 albicans.
- 30 ° C 하룻밤에 궤도 쉐이크 (180 RPM)에서 문화를 품다. 대부분의 C. albicans 변종이 조건 하에서 효모 세포로 성장합니다.
- 야간 문화를 (약 3,000 RPM, 5-10분) 원심 분리기, 멸균 PBS로 두 번 세포를 씻어하고, 산도 7.0과 미리 예열을 165 MM morpholinepropanesulfonic의 산성과 버퍼 RPMI 1640 매체의 20-25에 대해 ML의 마지막 펠릿을 resuspend 37 ° C가 (이 매체에 지금부터 간단하게 "RPMI 1640"이라고합니다).
- hemacytometer를 사용하여 셀을 계....
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토론
여기 XTT를 사용하여 biofilm 내에서 세포의 대사 활동을 측정 colorimetric 방법으로 결합 캔디다 biofilms의 형성을위한 단순하고 신속하고 경제적이며 높은 재현성 96 웰 플레이트 microtiter 모델을 설명합니다. biofilm 형성을위한이 96 잘 microtiter 플레이트 모델은 원래 C. 위해 개발되었습니다 albicans하지만 다른 캔디다 종에 사용될 수 있습니다. 쉽게 다른 곰팡이 유기체에 대한 적응. 방법은 여러 매개 변수 및 biofilm 형성에 영향을 미치는 요인을 조사하고 여러 곰팡이 격리 및 / 또는 돌연변이 종자의 biofilm - 형성 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 하지만 아마도 가장 중요한 것은,이 방법은 biofilms 내에서 세포의 antifungal 자화율 테스트 결정에 매우 유용합니다.
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공개 사항
JLL - R은 antifungal 요원을 개발 MicrobeHTS 테크놀로지 주식 회사에 지분을 소유하고 있습니다. MicrobeHTS 테크놀로지 주식 회사는 이러한 연구에 대한 재정 지원을 제공하지 않습니다.
감사의 글
실험실에서 Biofilm 관련 작업은 부여에 의해 자금 치과 & Craniofacial 연구 및 알레르기 및 전염병 (JLL - R 있습니다.)에 대한 국립 연구소의 국립 연구소에서 R21DE017294 및 R21AI080930 번호가 있습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIDCR, NIAID 또는 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Sabouraud-dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | 분리된 진균의 신선한 하위 배양을 위한 플레이트 준비용 |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | 하룻밤 동안의 액체 배양 증식용 배지 |
| L-glutamine이 첨가된 sodium bicarbonate 미함유 RPMI-1640 | Cellgro | 50-020-PB | 바이오필름 형성을 위한 액체 배지 |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | RPMI 1640 완충용 |
| 인산염 완충 식염수, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | 세척용 완충액 |
| XTT sodium salt | Sigma-Aldrich | X4251 | 조제 방법은 위 내용을 참조 |
| Ringer’s lactate | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | XTT 용액 조제용 |
| Menadione | Sigma-Aldrich | M5625 | 주의: 피부 접촉, 흡입 또는 섭취 시 위험함 |
| 페트리 접시 | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 15 ml 원추형 원심분리 튜브 | Corning | 430790 | |
| 50 ml 원추형 원심분리 튜브 | Corning | 430828 | |
| 96-well 마이크로타이터 플레이트: 폴리스티렌, 평평한 바닥, 조직 배양 처리됨 | Corning | 3595 | |
| 멀티채널 피펫 및 팁 | Eppendorf | ||
| 배양기 | Any Supplier | ||
| 마이크로타이터 플레이트 리더 | Any Supplier |
참고문헌
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A.
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재인쇄 및 허가
