Method Article

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

DOI:

10.3791/2413

⸱

December 22nd, 2010

 , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Johns Hopkins Physical Sciences Oncology Center and Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

外因性ヒアルロン酸（HA）と癌細胞の相互作用の高分解能解析を可能にする斬新なアプローチが説明されています。パターニングされた表面は、カルボジイミド化学とマイクロコンタクトプリンティングを組み合わせることによって作製されています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

癌の浸潤や進行は、腫瘍の微小環境内での増殖因子/サイトカインや細胞外マトリックス（ECM）成分による複雑な規制下にある運動性細胞の表現型を伴います。ヒアルロン酸（HA）は、強化の侵入、増殖、および血管新生1で腫瘍の進行を容易にするために確認されている間質ECMコンポーネントです。その細胞表面の受容体CD44とHAの相互作用は、それによって転移拡散2-3増加、腫瘍細胞の増殖、生存、および移行を促進するシグナル伝達事象を誘導する。 HAは、D -グルクロン酸とDN -アセチルグルコサミンの繰り返し単位から構成される陰イオン性、nonsulfatedグリコサミノグリカンである。 、二糖繰り返し単位のカルボキシル及びヒドロキシル基の存在のためにネイティブHAの大部分は親水性とphotoreative固定化4-5硫酸基を導入する化学修飾の影響を受けやすいです。表面にHAの固定化を含むこれまでの研究では6-7表面上に細胞接着を制御するために、HAのbioresistant挙動とその硫酸化誘導体を利用する。これらの研究では細胞接着には、優先的に非HA模様の領域で発生します。

外因性のHAと細胞間相互作用を分析するために、我々は、制御の研究とHAと癌細胞の相互作用の高解像度可視化を可能にするパターン化された官能化された表面を開発しました。我々は、ガラスの表面にHAの離散パターン領域を定義するためにマイクロコンタクトプリンティング（UCP）を利用。 HAを固定化するカルボジイミドリンク化学を適用する"テザリング"のアプローチは8を使用しました。ガラスの表面は、マイクロコンタクトをアミノシランで印刷し、パターン化された配列にHA固定化を有効にするEDCとNHSの最適比率のHA溶液と反応させた。 MCPを搭載したカルボジイミド化学を組み込むと、in vitroでのアプリケーションに適したサーフェスを作成、定義された領域にHAの固定化を可能にした。両方の結腸癌細胞および乳癌細胞は、暗黙的にHAマイクロパターン表面と相互作用した。癌細胞の接着は、48時間で増殖して24時間以内に起こった。 HAマイクロパターン表面を使用して、我々は癌細胞の接着は、HA受容体CD44を介して起こることを示した。さらに、HA柄の表面は電子顕微鏡（SEM）と癌細胞の接着剤の突起の許容される高解像度の画像をスキャンし、外因性のHA上で癌細胞の運動性を分析するためにHAパターンで拡散との互換性があった。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。マイクロパターンスタンプ作製のための標準的なフォトリソグラフィー

  1. エタノールで新しいシリコンウエハをリンスし、空気の流れで水分を拭き取ります。ウェハを処理し、全体のプロセスの間に表面欠陥を防止するために鉗子を使用してください。
  2. SU - 2025ネガ型フォトレジストを塗布し、カバーウエハの表面を回転させるウエハを転送する。フォトレジストとウェーハの少なくとも80％をカバーしています。 3000rpmの時に30秒間続いて600rpmで10秒間スピンコート、。フォトレジストの感光性のために、前方にこの点から、部屋の照明をオフにしてください。
  3. 3分間95℃で"ソフトベーク"のためにホットプレートにコーティングされたシリコンウェハをフォトレジスト転送する。ホットプレートから外し、1分を冷却することができます。
  4. フォトレジストで覆われたシリコンウェハの上に所望のパターンを持つプレハブマスクを置き、20秒間紫外線（UV）照射（350〜450 nm）にさらす。
  5. 110"ハードベーク"のためのホットプレートに転送シリコンウエハ℃で6分間。
  6. ライトの電源を入れ、ホットプレートからウェハを取り外す。明確なパターンは、この時点で表示されるはずです。
  7. 慎重にSU - 8フォトレジストの現像液でシリコンウエハをリンス。現像液の3洗浄した後、エタノールですすいでください。いずれかの白い残留物が存在する場合は、フォトレジスト....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提示HAの微細方法は、外因性HAと細胞の相互作用の研究が可能になります。 HAは、癌の進行1に重要な役割を果たすことが知られているしかし、二次元のHAパターニング表面上での癌細胞の相互作用を調査する限られた研究が行われている。外因性HAの微細パターンで制御可能研究は癌細胞の接着、成長、および移行の高解像度可視化を可能にし、癌のさらなる基礎を解明することができる。

カルボジイミドの化学とマイクロコンタクトプリンティングを組み合わせることにより、我々は癌細胞の相互作用を研究するために、異なるHAパターンで表面を開発しました。このメソッドは、一貫してを含む細胞培養および解析技術と互換性のある表面をパターン化が、免疫蛍光染色、走査型電子顕微鏡、阻害、移行、などに限定されないことができます

さらに、フォトリソグラフィ技術は、特定のアプリケーション用のHAの固定化を制御するために、任意のパターンの簡単な微細加工を可能にする。例えば、線形ストライプでPDMSスタンプを製造する線形配列でHAを固定化だし、パターニングされた.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

許可を得て複製したビデオの概略図;著作権ワイリー- VCH出版社＆Co KGaA社。ディッキンソンLE、マラヤS、生体材料を使用して、胚性幹細胞の分化のニッチを再構築Gerecht S.。 Macromol。バイオサイエンス。 2010; 10月21日。 [印刷の前にトップ|]。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、国立科学財団を通じて、材料研究科学工学センターの一部として資金を供給ジョンズホプキンス、少なくとも表面分析実験室の使用を認めます。 LEDはIGERT研修生と国立科学財団大学院のフェローです。この研究は、部分的にNIHの助成金U54CA143868によってサポートされていました。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SU-2025 フォトレジストマイクロケム(株)
SU-8の開発元MicroChem Corp.
Sylgard 184Dow Corning
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)Sigma-Aldrich281778
2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane)株式会社GelestSIM6492.7
1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドサーモフィッシャーサイエンティフィック(株)22980
N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)24500
オレセイン標識ヒアルロン酸(FL-HA)Sigma-AldrichF117710mlの脱イオン水で再構成
MDA-MB-231乳がん細胞ATCCHTB-26
LS174t結腸がん細胞ATCCCl-188
Y111069であるY020100フル

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
  2. Hamilton, S. R. The Hyalur....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hyaluronic AcidMicropatterned SurfacesCancer Cell AdhesionMicrocontact PrintingCarbodiimide ChemistryScanning Electron MicroscopyCD44 ReceptorHA ImmobilizationCell Motility AnalysisTumor Microenvironment

Related Articles