Summary
그것은 널리 본문에 기계적 세력 세포 분화와 증식에 영향을 미칠 수 있음을 이해합니다. 여기 유연한 micropatterned 기판에 교양 세포를 막기 위해 uniaxial 순환 인장 응력을 제공하는 맞춤식 생물 반응기의 사용을 보여주는 비디오 프로토콜을 제시한다.
Abstract
생물 학적 조직의 개발 및 유지 보수의 기계 군대의 역할은 물론 같은 뼈 리모델링, 근육 비대 및 평활근 세포 소성과 같은 몇 가지 기계 규제 현상을 포함하여 문서화되어있다. 그러나, 참여 세력은 종종 모니터링하고 생체내 제어하기가 매우 복잡하고 어렵습니다. 더 나은 세포에 기계적 세력의 영향을 조사하기 위해, 우리는 탄성 점막에 교양 자기편 세포 uniaxial 순환 인장 응력을 적용하기위한 체외 방식에을 개발했습니다. 이 방법은 원하는 힘을 적용하는 전동 캠 - 로터 시스템 맞춤 설계 생물 반응기를 활용합니다. 여기서 우리는 변형의 방향과 동양 세포 micropatterned의 지형을 가진 실리콘 막,이 경우를 포함하여 각 "스트레치 챔버 '의 다양한 구성 요소를 조립하는 방법을 보여주는 단계별 비디오 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한, 챔버 스를 살균 막에 세포를 심는 생물 반응기에 챔버를 래치와 기계 매개 변수 (예 : 크기와 변형의 속도) 조정 절차를 설명합니다. 이 특정 프로토콜에 설명된 절차는 변형의 방향에 평행 방향으로 10 μm의 다양한 채널로 실리콘 점막에 인간 mesenchymal 줄기 세포을 심는 특정 있습니다. 그러나, 방법이 시스템의 제공 자료가이 주제에 대한 유사 콘텐츠 수를 수용할 수있을만큼 유연 : 변형 속도, 크기, 기간, 세포 유형, 멤브레인 지형, 막 코팅 등 모든 원하는 응용 프로그램 또는 맞출 수 결과. 이것은 체외에서 세포에 적용 uniaxial 인장 변형의 영향을 조사하는 강력한 방법입니다.
Protocol
주 0 - 실험 하루 전에 살균
- 플라스틱 욕조에 재료를 넣고 2 시간 동안 70 % 알코올로 소독 :
- 챔버스
- 뚜껑
- 프레임 (전체 3 개)
- 나사
- 고무 가스켓
- 집게
- 가위
- 헥스 렌치
- Aquet 비누와 증류수로 깨끗이 세포막.
- 10 분 70 % 알콜에 세포막을 Sonicate.
- 플라스틱 사각 접시에 깨끗한 세포막을 놓으십시오. 패턴 세포막을 사용하는 경우, 패턴 측면이 (막의 한쪽에 스프레이 알코올과 홈을 실행할 수있는 액체에 대한보고)까지 얼굴 있는지 확인합니다.
- 2 시간 동안 70 %의 알코올로 덮여 세포막을 둡니다.
- 내일 아침 autoclaving 위해 알루미늄 호일로 패키지 장갑.
- 내일 autoclaving 위해 증류수 2 % (중량 / 부피) 젤라틴 솔루션 (2g/100mL)합니다.
- 70 % 알콜에 2 시간 살균 후, 야간 자외선에 대한 후드로 모든 폴리머 재료와 세포막을 (비 autoclavable 소재) 장소 :
- 챔버스
- 뚜껑
- 프레임 (전체 3 개)
- 세포막
- autoclavable 가방에 나머지 재료를 패키지 :
- 나사
- 고무 가스켓
- 집게
- 가위
- 헥스 렌치
1 일 - 스트레치 챔버스 조립
- 압력솥의 집게, 가위 20 분 총 240 ° F에서 작은 압력솥을 사용 헥스 렌치, 나사, 가스켓, 장갑, 그리고 젤라틴
- UV에서 세포막을 제거하고 ~ 1 분 O 2 플라즈마 (최대 패턴 사이드)로 처리합니다.
- TC 후드에 젤라틴과 플라즈마 처리 세포막의 패턴 영역을 커버. 자외선을 쬐면 분 동안 코트 30.
- PBS 2X 각 막 씻으십시오. 2 세척 후, 실에 쉽게 조립, 그들이 미끄러 유지하는 세포막의 일부 PBS 두십시오. (또한 쉽게 조립을위한 가스켓에 기름칠이 PBS를 사용한다).
- (조립 중 autoclaved 장갑을 착용) 회의소로 세포막을 조립
- 하나의 나사를 사용하여 프레임의 두 가지 주요 부분을 연결합니다.
- 프레임을 뒤집어하고 프레임쪽으로 젤라틴 코팅 사이드 얼굴 (패턴 부분은 중앙에 있어야합니다) 그래서 위에 막 놓으십시오.
- 양쪽에 가스켓을 사용하여 프레임에 멤브레인를 고정합니다.
- 부드러운 사용에 가스켓을 누르면, 심지어 압력 때문에 같은 멤브레인 해낼 수 없습니다.
- T - 바에 조립 프레임을 연결합니다.
- 거꾸로 챔버에 프레임과 장소를 뒤집기. 30 분 프레임과 막의 UV 백 사이드
- 다시 프레임을 플립, 그리고 회의소 (제어 챔버에 대한 변화하지만, 스트레치 챔버 들어, 챔버 하단 프레임의 끝 부분을 연결하는 두 개의 나사를 사용해야합니다, 그리고 단일 나사를 제거할 필요로 나사 ) 함께 프레임의 두 가지를 들고. 30 분 UV 프론트 사이드. 점막이 다음 단계로 진행하기 전에 완전히 말랐어요, 또는 다른 세포 솔루션 시딩 동안 벗어 버리는 수 있는지 확인하십시오.
- 종자 세포. 3 세포막 1 판 = 지역의 지역은 너무 막 당 합류 접시의 1 / 3을 사용합니다. 멤브레인 당 세포 솔루션 1 ML을 사용합니다. 1.5mL보다 더 솔루션을 계속하기 어려운 것입니다. 전용 패턴 영역에 셀 솔루션을 넣어, 그리고 주변의 솔루션을 보급하기 위해 피펫 팁을 사용합니다. 실 커버하고 세포 후드 30 분만에 RT를 위해 첨부하자.
- 인큐베이터에 방을 이동하며 세포는 1 개 시간 동안 부착하자. 셀 솔루션 벗어 버리는시키는 피하기 위해 회의소 이동 아주 조심해야! 솔루션은이 시점에서 굴러 떨어지면 챔버의 세포 생활이 엉망이 될 것입니다.
- 후드로 챔버를 반환 20 ML 미디어를 추가합니다.
- 알루미늄 호일 (또한 알코올과 물을 뿌리)으로 덮여있다 알코올 세척 욕조에 플레이스 실. 배양기를 (10 % CO 2) 운동 실 이동합니다.
- 스트레치 머신에 보안 실. 세포가 더 이상 야간 첨부하고, 다음날에 스트레치를 시작하자. (참고 : 스트레치 머신에 실 퍼팅 때, 챔버 스를 배치하기 전에 "제로"위치에 컴퓨터를 잠금 다음 기어 주변의 고무 밴드를 조이는 데 기억 시스템을 시작하기 전에 기어 잠금을 해제하는 것을 잊지 마십시오.).
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Discussion
베인스 외. 첫 번째 셀 1 기계적 힘을 전달하기 위해 유연하고 탄성 기판을 사용하여 체외에서 세포의 기계적 자극에 대한 시스템의 사용을보고했다. 이 시간 이후로,이 디자인에 많은 변화가 잉태하여 이용하고 있습니다. 일부 실험실 사용자 정의 - 기본 장치를 사용하는 동안 여러 기계 스트레치 시스템은 이름 "Flexercell"(Flexcell 국제 주식 회사)에서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서는 우리가 실험실에서 하나의 장치의 설치 및 사용을 설명합니다.
이 프로토콜에 묘사된 맞춤식 "스트레치 머신은"다른 세포 유형의 2,3에 uniaxial 순환 스트레인의 효과를 조사하기 위해 여러 연구에서 사용되고 있습니다. 이 기계는 기계적 스트레인 연구의 다양한 사용할 수 몇 가지 조정 매개 변수를 가진 다목적 기기입니다. 여기에 묘사된 설치 문화 자기편 세포 uniaxial 순환 변형을 제공하는 독특하고 강력한 방법을 나타냅니다.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
