Summary
Abbiamo sviluppato un modello di scarico degli arti posteriori alternant nei topi. Il vantaggio principale del nostro arti posteriori scarico coda anello metodo più convenzionale Morey-Holton coda trazione tecnica è una procedura semplice semplice che riduce al minimo lo stress sull'animale.
Abstract
Il Morey-Holton arti posteriori scarico (HU) è un metodo ampiamente accettato National Aeronautics and Space Administration (NASA) con base a terra modello per lo studio disuso-atrofia nei roditori 4-6. Il nostro studio ha valutato un metodo alternant al gold-standard Morey-Holton HU coda trazione tecnica nei topi. Cinquantaquattro topi di sesso femminile (4-8 mesi). HU sono stati per 14 giorni (n = 34) o 28 giorni (n = 20). Recupero da HU è stata valutata dopo 3 giorni di deambulazione normale gabbia seguenti HU (n = 22). Di età compresa tra i topi abbinati (n = 76) è servito come peso-cuscinetto controlli.
Prima di HU un anello di coda si è formata con un filo di 2-0 sterile acciaio chirurgico che è stato passato attraverso il 5 °, 6 ° o 7 ° inter-vertebrali spazio disco e racchiusi in un anello da cui sono stati sospesi i topi. Posizione vertebrale per la coda-anello è stato scelto per bilanciare opportunamente il peso corporeo dell'animale senza interferire con la defecazione.
Abbiamo determinato il successo di questa nuova tecnica HU, valutando il peso corporeo prima e dopo HU, il grado di atrofia soleo, e HU massa surrenalica seguente. Il peso corporeo dei topi prima di HU (24,3 ± 2.9g) non in modo significativo declino subito dopo l'14 quinquies del HU (22,7 ± 1.9g), 28d di HU (21,3 + 2,1 g) o dopo tre giorni di recupero (24,0 ± 1,8 g) . Massa muscolare soleo significativamente diminuito (-39,1% e -46,6%) a seguito HU per 14 giorni e 28 giorni rispettivamente (p <0,001). A seguito di 3 giorni di massa recupero soleo significativamente aumentata al 74% dei valori di controllo. Pesi surrenali di topi HU non erano differenti rispetto ai topi di controllo.
Il successo del nostro metodo romanzo di HU è evidenziato dal mantenimento del peso dell'animale, paragonabile pesi ghiandola surrenale, e l'atrofia soleo seguenti HU, corrispondenti ai valori attesi letteratura 2, 7, 8. I vantaggi principali di questo metodo HU includono: 1) la facilità d'esame coda durante la sospensione, 2) ha ridotto la probabilità di code cianotico, infiammato, e / o necrotiche frequentemente osservati con la coda-taping e HU, 3) senza possibilità di topi masticare la trazione nastro e in uscita dell'apparato sospensione e 4) e un rapido recupero dell'attività gabbia normale subito dopo l'HU.
Protocol
Pre-Chirurgia Strumenti / Materiali
- Tagliafili / pinze
- Garza 2 x 2 "pastiglie
- Riscaldamento pad
- Bastoncini di nitrato d'argento
- Guanti chirurgici sterili
- Isoflurano anestetiche per via inalatoria
- Clorexidina gluconato 4% (antisettico lavaggio chirurgico)
- Sterile 2-0 sutura acciaio chirurgico
- 25 X 5 / 8 A gauge (autoclavato)
- Hemostat (autoclavato)
- Acciaio sutura chirurgica
Procedura di chirurgia
- Creare un campo sterile. Seguire la procedura sterile.
- Anestetizzare il mouse con 2 - 3% isoflurano.
- Posizionare il mouse sul pad riscaldamento.
- Scrub coda con una soluzione di clorexidina.
- Individuare 5, 6 o 7 ° spazio intervertebrale (tra due gobbe ossea sulla coda, inizia a contare dalla fine di peli sul corpo, alla base della coda).
- Usa hemostat e ago 25G per fare un foro pilota tra due vertebre, nello spazio intervertebrale.
- Utilizzare i tronchesi per tagliare la sutura in acciaio 10 cm.
- Rimuovere l'ago ed inserire sutura in acciaio attraverso il foro, 5 cm di sutura su entrambe le estremità della coda.
- Ogni lato della coda dovrebbe avere + 5 cm di sutura.
- Luogo punta del pollice sulla coda.
- Usa la tua mano libera e il vento la sutura in acciaio sulla punta del pollice e ruotare le estremità per formare un grande anello. La parte ferita o circolare deve essere + 3 mm di lunghezza.
- Rimuovere il pollice.
- Morsetto un filo di sutura con la hemostat e piegare in un ciclo più piccolo, alla fine del quale è collegato il più vicino possibile alla torsione sul circuito originale di grandi dimensioni.
- Tagliare il cavo in eccesso, e piegare il filo intrecciato dietro.
- Se c'è un eccesso di sanguinamento, è possibile fermare con i bastoni nitrato d'argento.
- Spegnere il mouse isoflurano e posto in una gabbia singola casa a recuperare per 5-7 giorni prima di scarico degli arti posteriori. Gli anelli di coda rimanere impigliato se più di un topo è alloggiato insieme.
1. Procedura di scarico degli arti posteriori
Materiale
- Dimensioni 10-24 x 4 viti, una per ogni animale.
- Nylon Dado di blocco dimensioni 10-24, uno per ogni animale.
- Dado di ala misura 10 x 24, due per ogni animale.
- Rondella ¼ X 1, due per ogni animale.
- Girevole di pesca con dimensioni moschettone # 6, 1-11/16 ", e un animale per.
- Metallo macchina da cucire bobina. Un animale per.
- Graffetta piccola per S a forma di gancio, una per ogni animale
- Pinze.
- 2 x "garza 2.
- 2 "nero carta legante morsetti.
- Duct tape / lab nastro.
- 1-3/8 "bar in acciaio placcato scanalato che si estende leggermente oltre la lunghezza della gabbia
- 50cm X 40cm x 20cm gabbia (gabbia di ratto).
- Bottiglia d'acqua con tubo piegato.
- Filo di acciaio inossidabile, a forma di U per supportare bottiglia d'acqua.
Gabbia di installazione
- Posare il "1-38 bar in acciaio placcato scanalato sopra la parte superiore della gabbia, e nastro temporalmente giù con del nastro adesivo.
- Vite 1 galletto alla vite della macchina, inserire una rondella, e inserire la vite attraverso la macchina in lamiera di acciaio scanalato ± 15 cm dal bordo della gabbia.
- Aggiungere un altro rondella e dado ad alette. Stringere entrambi galletti, ma non serrare, in quanto sarà necessario fare aggiustamenti successivi.
- Inserire la vite di macchina attraverso il foro centrale della bobina.
- Per evitare che la bobina di cadere, avvitare il dado di bloccaggio in nylon fino alla fine della vite di macchina. La bobina deve girevole liberamente.
- Inserire il gancio girevole dalla pesca attraverso la parte inferiore della bobina.
- Utilizzare pinze a formare una S a forma di gancio dalla graffetta. (Tagliare due centimetri dalla clip di carta a formare un gancio).
- Inserire un'estremità del S a forma di uncino nel foro della pesca girevole e un pizzico si chiuse con le pinze.
- Posizionare il filo a forma di U, parallelamente alla vite della macchina, sulla parte interna del lato della gabbia, e piegare il back end per supportare una bottiglia piena d'acqua.
- Inserire l'acqua in bottiglia a forma di U a filo, con il spicket rivolto verso il basso, ma non toccare il fondo.
- Piegare le 2 "legante morsetto aperto, in modo che non può chiudere chiudere. Basta tensione sufficiente per contenere 3 a 4 pezzi di cibo in esso senza cadere. Questo è prevenire la forza della pinza da schiacciare il cibo, o reprimere il il mouse naso.
- Posto 3 a 4 pezzi di roditore chow nel morsetto legante.
Arti posteriori di scarico di Mouse
- Inserire l'estremità aperta del S a forma di uncino attraverso l'anello più piccolo dell'anello di coda.
- Regolare l'altezza del mouse svitando o avvitando il dado sulla vite inferiore della macchina. Le estremità inferiori non deve essere carico. Una volta che l'altezza ottimale si ottiene serrare il dado superiore dell'ala.
- Riposizionare la bottiglia d'acqua, e U filo in modo che il topo non può salire sul spicket con le sue arti posteriori. Fissare la bottiglia d'acqua con del nastro adesivo al lato della gabbia.
- Posizionare il morsetto legante con il cibo sul fondo della gabbia in modo che il mouse non si può salire su di essa; nastro giù con del nastro adesivo.
- Ripetere la stessa procedura se più di un animale è scaricato arti posteriori sul lato opposto della gabbia. Casa di due animali per gabbia, spazio agli animali in modo che possano quasi si toccano.
- Utilizzare il X 2 2 garza per avvolgere liberamente la coda del mouse sul girevole pesce. Utilizzare un piccolo pezzo di nastro per avvolgere la garza, la garza di fissaggio alla coda. Questo passo è importante per evitare la coda da cadenti verso il basso, portando ad una pozza di sangue nella punta della coda e che la coda di divenire necrotico.
- Aggiungere una piccola quantità di biancheria da letto pannocchia alla gabbia. Non aggiungere letto troppo altrimenti il mouse da un cumulo di biancheria da letto e cerca di caricare arti posteriori sul letto.
2. Rappresentante dei risultati:
Per stabilire il successo della coda-ring tecnica HU abbiamo misurato peso corporeo degli animali prima della chirurgia anello coda, e prima e dopo HU e recupero; massa muscolare soleo e massa surrenalica in tutti i gruppi.
Del peso corporeo dei topi per tutto l'esperimento sono mostrati in Figura 1. Del peso corporeo dei topi prima dell'intervento anello di coda (24,7 ± 3,5 g) non sono risultati significativamente differenti dopo 5 giorni di recupero da un intervento chirurgico anello coda (24,3 ± 2.9g) prima di HU. Né il peso corporeo in modo significativo declino subito dopo 14 giorni di HU (22,7 ± 1.9g), 28 giorni di HU (21,3 + 2,1 g) o dopo 3 giorni dalla ripresa HU (24,0 ± 1,8 g). Anche se HU per 14 e 28 giorni ha comportato una piccola perdita (-6,8% e il 12%) ma non significativo in massa corporea, i topi completamente recuperato alla loro pre-HU del peso corporeo dopo 3 giorni di recupero. Consumo di cibo per topi di controllo ambulatoriale e topi HU è mostrata in Figura 3. Media giornaliera di cibo non era differente nei topi HU nell'arco di 28 giorni rispetto ai controlli.
Abbiamo osservato significativa atrofia muscolo soleo seguenti HU per il 14 e 28 giorni (-39,1% e -46,6%) che indica una procedura efficace HU (Figura 2). Inoltre questo grado di atrofia è coerente con i valori attesi letteratura per 2-4 settimane di HU 2, 7, 8. A seguito di 3 giorni di recupero da HU soleo di massa significativamente aumentata al 74% dei valori di controllo. Soleo di massa nel gruppo di recupero era significativamente maggiore rispetto ai due gruppi HU, ma ancora significativamente inferiore rispetto agli animali di controllo ambulatoriale.
Surrenali pesi sono stati misurati come indicatore dello stress degli animali, sia le ghiandole surrenali a destra e sinistra sono stati asportati e pesato. I pesi medi erano paragonabili per il controllo e topi HU topi in tutti i gruppi (Figura 4).
In precedenza nei ratti abbiamo dimostrato che il tasso di successo per il numero di animali all'inizio del HU rispetto al numero di animali che hanno completato HU senza uscire di apparecchi sospensione (a causa di animali masticazione attraverso la coda di trazione del nastro) è stato 10 su di 12 con il Morey-Holton tecnica 1. Nessuno dei topi (n = 54) in questo studio mai sceso dal sospensione prima del completamento del periodo di HU. Abbiamo fatto comunque, hanno un mouse che ha sviluppato una coda severamente infiammate. Quando l'infiammazione è diventato evidente, abbiamo rimosso l'anello di coda per consentire la zona infiammata di guarire, e successivamente immesse un'altra coda-ring per completare la durata di HU.
In passato, quando abbiamo usato la Morey-Holton metodo di HU, di solito 1-2 eliminare i topi / gruppo perché escono dell'apparato sospensione. Con il sentiero ad anello metodo non ci sono stati episodi di topi inavvertitamente uscendo dell'apparato HU durante il periodo di HU per 14 o 28 giorni (n = 54 topi).
Figura 1. Cambiamenti del peso corporeo (media ± DS). Abbreviazioni: CON: peso-cuscinetto topi di controllo (n = 76); Pre-HU: tutti i topi prima di HU (n = 54); HU14: arti posteriori topi scaricati per 14 giorni (n = 34); HU28: arti posteriori topi scaricati per 28 giorni (n = 20); REC: topi arti posteriori scaricato permesso di recuperare gabbia per 3 giorni (n = 22). Nessuna differenza significativa nel peso corporeo è stata osservata tra i gruppi.
Figura 2. Soleo atrofia muscolare (media ± DS). Abbreviazioni: CON: peso-cuscinetto topi di controllo (n = 76); HU14: arti posteriori topi scaricati per 14 giorni (n = 34); HU28: arti posteriori topi scaricati per 28 giorni (n = 20); e REC: topi arti posteriori scaricato permesso per recuperare gabbia per 3 giorni (n = 22). * Significativamente diversi (p <0,001) rispetto al peso-cuscinetto di controllo (CON). δSignificantly differenti (p <0,01) di entrambi i gruppi HU.
467fig3.jpg "alt =" Figura 3 "/>
Figura 3. Consumo alimentare (media ± DS). Media giornaliera di alimenti (g / die) durante peso-cuscinetto e lo scarico degli arti posteriori. Abbreviazioni: peso-cuscinetto topi di controllo (n = 76); HU: topi arti posteriori unloaded14 - 28 giorni. Nessuna differenza significativa tra i gruppi HU CON e sono stati osservati.
Figura 4. Messa surrenale (media ± DS). Abbreviazioni: CON: peso-cuscinetto topi di controllo (n = 76); HU14: arti posteriori topi scaricati per 14 giorni (n = 34); HU28: arti posteriori topi scaricati per 28 giorni (n = 20); e REC: topi arti posteriori scaricato permesso per recuperare gabbia per 3 giorni (n = 22). Nessuna differenza significativa è stata osservata tra i gruppi.
Discussion
Abbiamo valutato un metodo alternativo di topi scarico degli arti posteriori, che abbiamo deciso di essere di grande successo. La coda-ring metodo descritto qui è stato usato a lungo termine della sospensione degli arti posteriori, e di studiare HU recupero successivo. In ognuna di queste condizioni, non vi era alcuna evidenza di mancato adeguamento, come evidenziato dalla assunzione di cibo stabile, peso corporeo, e pesi surrenali dei topi. Questa coda anello tecnica HU è facile da eseguire e può facilmente essere incorporato con pochissima pratica chirurgica.
Ci sono diversi vantaggi di coda-ring metodo rispetto al tradizionale Morey-Holton 5, 6 metodo. In primo luogo, la pelle e l'impianto sito anello sulla coda che sono sempre visibili, per cui in caso di problemi è evidente subito, non solo alla fine del periodo di sospensione. In secondo luogo, gli animali non sono in grado di uscire dell'apparato sospensione in qualsiasi momento durante HU, ovviando alla necessità di fare una determinazione di se mantenere un mouse o non nel set di dati. Inoltre, i topi non si preoccupano l'apparato ring e quando vengono rilasciate da HU per il recupero, non manomettere le loro code, consentendo una fase di ripresa senza soluzione di continuità dopo HU. Infine, arti posteriori topi scariche, con la coda anello metodo di mantenere il proprio peso corporeo meglio di arti posteriori topi scaricato dal Morey-Holton coda trazione tecnica. Nelle nostre mani dopo 14 giorni di HU abbiamo osservato una piccola perdita (-6,8%) ma non significativo di massa corporea. Mentre Ingalls et al. Osservata una diminuzione significativa -12% del peso corporeo nei topi dopo 14 giorni di HU dal Morey-Holton metodo 3. Anche se Ingalls non ha segnalato pesi surrenali, sembra che la nostra coda anello metodo conferisce meno stress sul mouse (pesi surrenalica nei nostri topi HU non sono differenti rispetto ai controlli) e una migliore manutenzione del peso corporeo durante tutto il periodo di scarico degli arti posteriori.
In sintesi, un metodo anello coda degli arti posteriori di scarico è stato sviluppato e testato su topi HU per 14 e 28 giorni, e su topi restituito al recupero gabbia per 3 giorni dopo HU. Sulla base dei pesi surrenali, massa corporea e l'assunzione di cibo, i topi sembrano essere adattato bene alla coda-ring apparato. La coda-ring scarico degli arti posteriori è un metodo utile, semplice alternativa al tradizionale Morey-Holton tecnica di scarico degli arti posteriori.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Andrew J. Dunn, uno studente eccezionale di ricerca universitari nel nostro laboratorio, per la sua assistenza tecnica e la cura per gli animali. L'Istituto Nazionale di Salute concedere HD058834 e l'Università del Missouri Scienze della Vita Compagnia finanziato questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wire cutters/pliers | Ace Hardware | 84-056 | |
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-901 | |
| Heating pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Silver nitrate applicators | ARZOL | 0001-2 | |
| Isoflurane,USP | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| Chlorhexidine Gluconate 4% | Purdue Products L.P. | NDC 67618-200-01 | |
| Sterile 2-0 surgical steel suture | Ethicon Inc. | SS-28 | |
| 25 X 5/8 A gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN 2516R | |
| Hemostat/ needle holder | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Size 10-24 X 4 machine screws | Hillman The Fastener Center | 90272 | |
| Nylon lock nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180141 | |
| Wing nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180243 | |
| Fender Washer size ¼ X 1 | Hillman The Fastener Center | 290012 | |
| Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” | Bass Pro Shop | 38-481-554-01 | |
| Metal sewing machine bobbin. | Singer Instruments | 45785 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| 2” black paper binder clamps. | Office Depot | 308957 | |
| Scotch Multi-Use Duct Tape | Office Depot | 790710 | |
| 1-3/8” Plated slotted steel bar | Home Depot | 548932 | Extends slightly beyond the full length of the cage |
| 50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage | Alternative Design Manufacturing | RC88D-PC | |
| Water Bottle | Alternative Design Manufacturing | WB16FS | |
| Stainless Steel wire | Small Parts, Inc. | SWX-4029 | U-shaped wire to support water bottle |
References
- Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).
- Fitts, R. H., Metzger, J. M., Riley, D. A., Unsworth, B. R. Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization. J Appl Physiol. 60, 1946-1953 (1986).
- Ingalls, C. P., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading. Journal of Applied Physiology. 87, 386-390 (1999).
- Morey, E. Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness. BioScience. 29, 168-172 (1979).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight. Bone. 22, 83-88 (1998).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading rodent model: technical aspects. J Appl Physiol. 92, 1367-1377 (2002).
- Thomason, D. B., Booth, F. W. Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting. J Appl Physiol. 68, 1-12 (1990).
- Thomason, D. B., Herrick, R. E., Surdyka, D., Baldwin, K. M. Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery. J Appl Physiol. 63, 130-137 (1987).
