Summary
Metodi per l'imaging bioluminescenza delle infezioni batteriche in animali viventi sono descritti. Gli agenti patogeni sono stati modificati per esprimere la luciferasi che permette l'imaging ottico intero corpo di infezioni negli animali vivi. I modelli animali possono essere infettati da agenti patogeni che esprimono luciferasi e il decorso della malattia conseguente visualizzati in tempo reale da parte di imaging bioluminescenza.
Abstract
Imaging è una tecnica preziosa che può essere utilizzata per monitorare i processi biologici. In particolare, la presenza di cellule tumorali, cellule staminali, specifici tipi di cellule immunitarie, agenti patogeni virali, parassiti e batteri possono essere seguiti in tempo reale all'interno di animali viventi 1-2. Applicazione di imaging bioluminescenza per lo studio di agenti patogeni presenta vantaggi rispetto alle strategie tradizionali per l'analisi delle infezioni in modelli animali 3-4. Le infezioni possono essere visualizzati all'interno di un singolo animale, nel tempo, senza richiedere l'eutanasia per determinare la posizione e la quantità del patogeno. L'imaging ottico permette la visione completa di tutti i tessuti e organi, piuttosto che il campionamento dei siti precedentemente nota l'infezione. Inoltre, l'accuratezza della inoculazione in tessuti specifici possono essere direttamente determinato prima di portare gli animali in avanti che sono stati inoculati senza successo in tutto l'intero esperimento. Variabilità tra gli animali possono essere controllati per, dal momento che l'imaging permette ad ogni animale da seguire individualmente. Imaging ha il potenziale per ridurre notevolmente il numero degli animali necessari a causa della possibilità di ottenere dati da numerosi punti di tempo, senza dover tessuti campione per determinare il carico patogeno 3-4.
Questo protocollo descrive i metodi per visualizzare le infezioni negli animali vivi utilizzando l'imaging bioluminescenza di ceppi di batteri ricombinanti che esprimono luciferasi. Lo scarabeo clic (CBRLuc) e luciferases lucciola (FFluc) utilizzano come substrato luciferina 5-6. La luce prodotta da entrambe le CBRluc e FFluc ha una lunghezza d'onda largo da 500 nm a 700 nm, rendendo questi giornalisti luciferases eccellente per l'imaging ottico in modelli animali che vivono 7-9. Ciò è dovuto soprattutto lunghezze d'onda della luce superiore a 600 nm sono necessari per evitare l'assorbimento da parte dell'emoglobina e, quindi, i viaggi attraverso il tessuto dei mammiferi in modo efficiente. Luciferasi è geneticamente introdotto i batteri per produrre segnale luminoso 10. I topi sono polmonare inoculati con batteri bioluminescenti intratracheally per consentire il monitoraggio delle infezioni in tempo reale. Dopo l'iniezione luciferina, le immagini sono acquisite con il Imaging System IVIS. Durante l'imaging, i topi vengono anestetizzati con isoflurano utilizzando un XGI-8 Sistema Gas Anethesia. Le immagini possono essere analizzati per localizzare e quantificare la sorgente del segnale, che rappresenta il sito di infezione batterica (s) e il numero, rispettivamente. Dopo l'imaging, la determinazione CFU viene effettuata sul tessuto omogeneizzato per confermare la presenza di batteri. Diverse dosi di batteri vengono utilizzati per correlare numeri batterica con luminescenza. L'imaging può essere applicato allo studio della patogenesi e la valutazione dell'efficacia di composti antibatterici e vaccini.
Protocol
1. Infezione polmonare da intubazione intratracheale
- Pesare topi e, opzionalmente, i marchi possono essere fatti sulle orecchie per una facile identificazione.
- Anestetizzare i topi con ketamina (100 mg per g di peso del mouse) e xilazina (10 mg per g di peso del mouse) per inoculazione intraperitoneale.
- Topi posto nelle gabbie fino completamente anestetizzato. Spremere le pastiglie dei loro piedi per controllare pedale riflesso. I topi dovrebbe visualizzare ridotta o nessuna reazione riflessa.
- Posizionare il mouse sul supporto intubazione sdraiato sulla schiena.
- Fissare un elastico a stare intubazione e poi metterlo sotto gli incisivi superiori del mouse. Utilizzare del nastro per fissare le gambe e le braccia sul supporto intubazione.
- Spostare delicatamente tougue dalla bocca con pinze.
- Inserire speculum con octoscope all'interno della bocca e guardare in orofaringe fino all'apertura della laringe è visibile.
- Filo guida anticipo coperto con cathether in trachea fino catether hub è al incisivi. Rimuovere il filo guida. Mettere in aria cathether per osservare l'espansione del torace e confermare l'intubazione corretta.
- Iniettare 50 ml di batteri (nelle immagini mostrate abbiamo usato bacillo di Calmette Guerin (BCG) che esprime clicca scarabeo rosso luciferasi (CBRLuc), costruito nel nostro laboratorio, ma ogni sforzo luminescenti batterica può essere utilizzato) soluzione attraverso cathether usando una siringa da 1 ml.
- Posizionare il mouse in una gabbia e osservarlo durante il recupero dall'anestesia.
2. Animali anestesia e preparazione per l'imaging bioluminescenza
I topi vengono anestetizzati con isoflurano utilizzando il XGI-8 Sistema Gas Aneshesia.
- Prima di utilizzare il sistema-8 XGI anestesia, pesare ogni canestro filtro al carbone e scrivere il peso e la data su di esso. Se il peso è di 50 grammi sopra del peso iniziale, sostituirlo con un nuovo contenitore.
- Controllare il livello isoflurano nel vaporizzatore e riempire se necessario.
- Accendere la pompa di evacuazione nella parte anteriore del XGI-8 sistema di anestesia e impostato su 8 lpm (litri per minuite).
- Accendere la fornitura di ossigeno dal cilindro ad alta pressione e impostarlo a 55 psig.
- Accendere l'ossigeno passare (in verde) sulla parte anteriore del sistema-8 XGI anestesia.
- Accendere il flusso di gas alla camera di imaging per impostare il livello di flusso del gas. Impostato a 0,25 litri al minuto e poi spegnere il flusso del gas.
- Accendere il flusso di gas alla camera di induzione dell'anestesia per impostare il livello di flusso del gas. Impostato a 1,5 litri al minuto e poi spegnere il flusso del gas.
- Accendere il isoflurano con il vaporizzatore e si mise al 2-2,5 per cento. Il livello di isoflurano può essere regolata a seconda del numero di animali utilizzati e il peso.
- Luogo topi nella camera di induzione e chiudere il coperchio. Accendere il flusso di gas alla camera di induzione. Topi posto nella camera per 5 - 10 minuites fino a quando sono anestetizzare completamente.
- Applicare una pomata ottico agli occhi per proteggere gli occhi del mouse durante l'imaging e posizionare il mouse nella camera di imaging in uno dei coni naso sul collettore di anestesia. Usa deflettore luce tra i topi per evitare il riflesso della luce su soggetti animali adiacenti.
- Iniettare luciferina (150 mcg / grammo di peso corporeo) per inoculazione intraperitoneale.
3. Bioluminescenza Imaging
- Avviare il software di imaging Living.
- Se il sistema non è stato inizializzato, inizializzare il sistema di Imaging IVIS.
- Impostare i parametri per l'imaging, cliccando configurazione sequenza nel pannello di controllo acquisizione IVIS.
Seleziona luminescenza e fotografare in modalità Imaging. Se l'opzione per effettuare DLIT ricostruzione 3D è desiderata, selezionare le immagini luce fotografica, luminescenti e strutturale come parte della sequenza di immagini.
Impostare tempo di esposizione da 0,5 sec a 10 minuti.
Impostare Binning e F / stop sulla base di luminosità prevista di campione.
Impostare eccitazione filtro per bloccare e filtrare le emissioni di aprire, a meno che progettando di acquisire specifiche lunghezze d'onda solo di luce. Nel caso di costituzione DLIT 3D, impostare filtri di emissioni multiple di diverse lunghezze d'onda per permettere la localizzazione precisa della fonte.
Set FOV da A a D a seconda del numero di topi o della regione di animali da acquisire. Selezionare A e B per 1 mouse, C per 2-3 topi, e D per 4-5 topi. - Clicca aggiungere nella procedura guidata immagine nel Pannello di controllo di acquisizione per aggiungere la sequenza di setup.
- Avviare la sequenza di immagini, cliccando acquisire.
In caso di costruzione DLIT 3D, immagini luminescenti saranno acquisite per i filtri delle emissioni a diverse lunghezze d'onda multiple. Immagini fotografiche della luce e strutturati saranno acquisite anche. - Durante l'acquisizione dell'immagine e modificare i livelli di immagine pannelli saranno visibili. Compila il più possibile dettagliate per ciascun esperimento in modifica immagine per assicurare un facile monitoraggio di immagini in tempi successivi e salvare le immagini.
- ReRemove i topi da IVIS immagini da camera e restituirli alle loro gabbie. Osservare il recupero da unesthesia per assicurare i topi non sono state influenzate dalla procedura. Gli animali devono essere monitorati costantemente fino a quando non riprendersi completamente da anestesia (di solito 1-2 minuti).
4. Ex vivo Imaging e Analisi CFU per la quantificazione dei batteri nei polmoni
- Iniettare topi con luciferina intraperitoneale nello stesso modo come per l'imaging, appena prima di eutanasia.
- Euthanize i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg pentobarbitol 5 minuti dopo l'iniezione luciferina.
- Espianto i polmoni dei topi e il luogo in sterili petri-piatti con pinza sterile e forbici.
- Luogo petri-piatto contenente organo espiantato in camera di imaging e di acquisire immagini bioluminescenza nello stesso modo come per il mouse tutto.
- Dopo l'imaging, rimuovere organi espiantati da Petri con pinze sterili e omogeneizzare in 1 ml di PBS.
- Diluire e del tessuto piatto sul supporto più appropriato selettivo. Tessuto omogeneizzato può essere conservato -80 ° C per la ri-placcatura se fosse necessario. In alternativa, il tessuto omogeneizzato può essere utilizzato per l'estrazione del DNA o RNA per quantificare i numeri batterica da qPCR.
5. Analisi di Imaging Luminescenza
- Start "Imaging Software Vivere" e sfogliare i file di immagine.
- Usare "Tool Palette 'per regolare le immagini. Clicca l'immagine Regolare di modificare la correzione / filtraggio impostazioni e min / max per le scale di colore individuali.
- Utilizzare strumenti di ROI nella lista a tendina per la quantificazione dell'intensità luminosa. Seleziona il ROI forma, numero e dimensioni. Trascinare il ROI cornice alla regione di interesse sull'immagine. Assicurarsi che tutte le ROI sono della stessa dimensione e forma. Clicca ROI misura e salvare, copiare e / o esportare dati quantitativi.
- Nel caso di DLIT ricostruzioni 3D, caricare sequenza di immagini tra cui l'immagine luce strutturata. Clicca topografia superficiale nello strumento Platte. Nella lista a discesa, fare clic sulla scheda Ricostruire per generare la topografia della superficie. Un pasticcio superficie apparirà nella finestra.
- Seleziona ricostruzione 3D DLIT nello strumento Platte. Nella lista a tendina, selezionare la scheda Proprietà per impostare le proprietà dei tessuti e lo spettro sorgente. Muscolare è consigliato nella maggior parte delle circostanze. Nell'elenco a discesa, fare clic sulla scheda Analizza per selezionare la lunghezza d'onda per l'analisi. Fare clic sulla scheda Parametri e confermare i valori di default o regolare i parametri DLIT se necessario. Clicca sulla scheda Ricostruire per iniziare l'analisi 3D.
- Quando la ricostruzione 3D è finito, la vista 3D mostrerà i risultati della ricostruzione 3D. Fare clic sulla scheda dei risultati per visualizzare i dati di analisi per la densità di fotoni, voxel e parametri dell'algoritmo DLIT.
- Salvare e / o esportare i risultati delle analisi ricostruzione 3D in figure e file di dati.
6. Rappresentante dei risultati:
Le immagini bioluminescenza di topi infettati con batteri bioluminescenti insieme ad un controllo del mouse non infetti sono mostrati in Figura 1. Il polmonare topi infettati con batteri bioluminescenti produrre segnale significativo dai polmoni (Figura 1). L'intensità di luminescenza è quantificato come flusso totale in un ROI (regione di interesse) (Figura 2). I dati quantitativi per l'intensità della luce è normalizzato per unità formanti colonia (CFU) di batteri ottenuti da polmoni per confermare che il segnale viene prodotto dai batteri bioluminescenti e può essere paragonato al controllo negativo. La posizione e l'intensità del segnale può essere ulteriormente analizzato da DLIT ricostruzione 3D della sorgente luminescente basata su tomografia della superficie del mouse 11. Queste analisi permettono la quantificazione e la localizzazione del segnale bioluminescente prodotto. I risultati di ricostruzione 3D di una fonte luminescente in topi infettati dimostra che la luce è prodotta dai polmoni del mouse (Figura 3). Le immagini ex vivo dei polmoni del mouse risultante confermare che luminescenza emessa dai polmoni, piuttosto che qualche altro tessuto o organo strettamente giustapposti (Figura 2C).
Figura 1. Di imaging polmonare luminescenza di topi infettati con batteri bioluminescenti taggati con CBRluc. Controllo del mouse non infetti è a sinistra e due topi infettati sono sulla destra. I topi sono stati infettati con batteri che esprimono CBRluc (n = 2) per via intratracheale. 10 minuti dopo l'iniezione luciferina, luminescenza immagini sono state acquisite per 10 minuti a 4 posizioni: dorsale, ventrale, lato sinistro e lato destro.
Figura 2. L'intensità della luce quantitative da topi infettati con batteri che esprimono CBRluc. (A, B) le immagini di luminescenza di analisi del ROI e il flusso totale di luce quantificati dal ROI in posizione dorsale e ventrale, rispettivamente. Topi infetti sono a sinistra e due topi infettati sono sulla destra. Luminescenza immagini sono state acquisite dai polmoni of topi infetti e non infetti con CBRlux (n = 2). L'intensità della luce intorno polmoni è stata quantificata mediante l'analisi del ROI. C) Immagini ex vivo di polmoni da non infetti (in alto) e infettati (in basso due set di polmoni) topi. Luciferina è stato iniettato 5 miniuts prima di eutanasia e le immagini sono state poi acquisite. I valori quantificati sono normalizzati a CFU.
Figura 3. La ricostruzione 3D della fonte bioluminescenza (s) da un topo polmonare infettato. Il mouse è stato infettato da batteri che esprimono CBRluc per iniezione intratracheale. La sequenza di immagini è stata acquisita utilizzando filtri di emissione diversi di lunghezze d'onda di serie da 540 nm a 700 nm. Una sequenza di immagini è stato utilizzato per la ricostituzione 3D per fonte di luminescenza in soggetti animali che conteneva un imag strutturato. A) La tomografia per mouse è mostrato in diverse posizioni: davanti, dietro, destra e sinistra. Le sorgenti luminose sono mostrati come voxel (caselle rosse all'interno del mouse 3D) che si trovano all'interno del polmone come determinato dalla ricostruzione. B) Photon mappa densiy dei dati misurati e simulati. Confrontando i misurati e simulati curve di densità di fotoni fornire le informazioni di qualità della ricostruzione. Buon risultato di qualità ricostruzioni in simili densità misurati e simulati fotone.
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Discussion
Anche se dopo questi protocolli di solito provoca immagini di alta qualità, è importante prendere in considerazione alcuni punti chiave per ottenere dati precisi e coerenti da studi di imaging. Luminescenza immagini dovrebbero essere acquisite che hanno conti da 600 a 60.000 per assicurare che il segnale è al di sopra di fondo e la fotocamera non è saturo. Se il segnale ottenuto è minore di 600 le condizioni di esposizione deve essere regolata per incrementare la conta. Se il segnale ottenuto è di oltre 60.000 la fotocamera è satura in alcune regioni. Quando la fotocamera è satura, la quantificazione non dovrebbe essere tentata nelle regioni saturo, anche se è ancora possibile e talvolta necessario in non-saturo regioni. Inoltre, la ricostruzione 3D non può essere effettuata con precisione quando sono saturi alcune regioni è incluso all'interno della regione in uso per la maschera per la ricostruzione. La regolazione del tempo di esposizione, binning e F / stop per acquisizione di immagini così come la modifica della regione di imaging o posizione animale in grado di controllare il segnale ottenuto e consentono l'analisi quantitativa dei dati. Così, in molti esperimenti è utile costantemente animali immagine in condizioni di esposizione multipla per garantire che almeno un set di immagini sarà nei limiti necessari per consentire l'analisi quantitativa.
E 'importante ricordare che l'espressione di un gene reporter possono influenzare la virulenza, il che rende necessario effettuare studi pilota per valutare l'impatto potenziale sul fitness in ceppi ricombinanti che devono essere utilizzati per l'imaging. Questo è uno dei limiti di imaging bioluminescente, in quanto richiede l'espressione di geni estranei nei batteri. Questo può spesso essere superata attraverso l'utilizzo di costrutti ottimizzato che utilizzano l'uso appropriato codone per le specie batteriche da studiare, titolazione dei livelli di espressione di geni reporter per ridurre l'impatto sul metabolismo o all'esame di più sistemi giornalista luminescenti che possono differire nel loro impatto sul fitness.
Un'altra variabile principale per gli studi di imaging con agenti infettivi è il livello del segnale prodotto da parte dell'agente di essere fotografato. Poiché non vi sono differenze nella soglia di rilevazione per ogni agente negli animali rispetto a in vitro, si raccomanda che gli studi pilota di utilizzo di più dosi infettive per ottimizzare i numeri agente prima di effettuare esperimenti più estesi. Il reporter bioluminescenti si dovrebbe anche essere ottimizzato per la tossicità trascrizione, traduzione e bassi, per garantire che il livello del segnale prodotto è il più alto possibile. Ottimizzazione dei giornalisti può essere realizzato in molti casi in vitro, ma la lunghezza d'onda della luce emessa avrà anche un impatto la luce prodotta dai giornalisti capacità ottimale di penetrare il tessuto dei mammiferi, il che rende importante valutare anche diversi reporter direttamente negli animali. Anche se ogni animale può essere seguito singolarmente, che controlla per una grande variabilità tra gli animali, è ancora necessario includere gli animali sufficiente a consentire la significatività statistica tra gruppi da determinare. Di solito, il numero degli animali dovrebbe essere 4-6 per gruppo, permettendo le differenze al livello più basso a due volte tra i gruppi che devono essere osservati in molti casi. Infine, il percorso inoculazione e la precisione di consegna ai tessuti appropriate e di numeri precisi agente contribuirà a garantire risultati uniformi, riducendo la variabilità complessiva tra gli animali.
Le proprietà spettrali della bioluminescenza prodotta è anche un fattore importante la possibilità di infezioni immagine in vivo. Nei tessuti dei mammiferi, la luce di lunghezza d'onda inferiore a 600 nm sono in gran parte assorbita da emoglobina, una componente importante del tessuto dei mammiferi. La profondità di penetrazione per lunghezze d'onda bioluminescenza aumenta drasticamente per lunghezze d'onda più lunga di 600 nm 8,12. Sia CBRluc e FFluc produrre bioluminescenza con una lunghezza d'onda largo, tra cui oltre 600 nm, rendendo questi giornalisti luciferases quasi ideale per imaging in vivo, anche nei tessuti profondi tra cui i polmoni e il fegato 7-8.
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Disclosures
Studi su animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della Texas A & M University.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano i membri Cirillo laboratorio per le discussioni di valore e di assistenza in tutto questo studio. Ringraziamo il Dr. Joshua Hill e il laboratorio del Dr. James Samuel per assistenza durante le riprese di questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla borsa 48523 dalla Bill & Melinda Gates Foundation e concedere AI47866 dal National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| Ketamine | Butler Animal Health Supply | ||
| Xylazine | MP Biomedicals | 158307 | |
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | |
| Fetal plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| Cathether (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| Guide wire | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| Octocope with speculum | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Xenogen IVIS system | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthsia System | Caliper Life Sciences | ||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | ||
| Transparent nose cones | Caliper Life Sciences | ||
| Light baffle divider | Caliper Life Sciences |
References
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