Konkurrenskraftiga Homing Analyser för att studien Gut-tropism T cell migration

Summary

Konkurrenskraftiga målsökande experiment gör det möjligt att direkt bedöma flyttande egenskaper av två olika cellpopulationer i en enda mus. Här har vi illustrerar detta förfarande genom att jämföra migration av ex vivo-genererade gut-tropism kontra icke-gut tropic celler T.

Abstract

För att utöva sin funktion lymfocyter behov av att lämna blod och migrera till olika vävnader i kroppen. Lymfocyter vidhäftning till endotelceller och vävnad extravasering är en flerstegsprocess som styrs av olika adhesionsmolekyler (målsökande receptorer) uttryckt på lymfocyter och deras respektive ligander (addressins) som visas på endotelceller ^{1 2.} Även om funktionen hos dessa vidhäftning receptorer delvis kan studeras ex vivo, det ultimata testet för deras fysiologiska betydelse är att bedöma deras roll under in vivo-lymfocyter vidhäftning och migration. Två kompletterande strategier har använts för detta ändamål: intravital mikroskopi (IVM) och homing experiment. Även IVM har varit nödvändigt att definiera den exakta bidrag från särskilda vidhäftning receptorer under vidhäftning kaskaden i realtid och i olika vävnader, är IVM tidskrävande och arbetsintensiv, det ofta kräver utveckling av avancerade kirurgiska tekniker, behöver den innan isolering av homogena cellpopulationer och den tillåter analys av endast en vävnad / organ vid varje given tidpunkt. Däremot konkurrenskraftiga målsökande experiment möjligt att direkt och samtidig jämförelse i migreringen av två (eller fler) cell delmängder i samma mus och även tillåter analys av många vävnader och av ett stort antal celler i samma experiment.

Här beskriver vi den klassiska konkurrenskraftiga målsökande protokoll som används för att bestämma fördel / nackdel för en viss celltyp till hem till specifika vävnader jämfört med en kontrollgrupp cellpopulation. Vi valde att illustrera flyttande egenskaper gut-tropism kontra icke gut-tropism T-celler, eftersom tarmslemhinnan är den största kroppsyta i kontakt med den yttre miljön och det är också den extra lymfvävnad med de bästa definierade flyttande krav . Dessutom har senaste arbete fastställt att vitamin A metabolit all-trans retinoinsyra (RA) är den viktigaste molekylära mekanism som ansvarar för att framkalla gut-specifik vidhäftning receptorer (integrin a4b7and kemokinreceptorn CCR9) på lymfocyter. Därmed kan vi skapa lätt ett stort antal tarm-tropism och icke tarm-tropism lymfocyter ex vivo genom att aktivera T-celler i närvaro eller frånvaro av RA, respektive, som slutligen kan användas i den konkurrensutsatta målsökande experiment som beskrivs här.

Protocol

1. Ex vivo-generationen tarm-homing och kontroll T-celler (se figur 1)

1. Isolera splenocytes genom att mosa en mjälte från vildtyp möss. Resuspendera cellerna fjädring i PBS och centrifugera i 5 "vid 400 x g. Avlägsna supernatanten och lyseras de röda blodkropparna genom resuspending cellpelleten i 4 ml ACK lyseringsbuffert i 2-3 minuter. Efter det, tillsätt 5 ml PBS. Centrifugera i 5 "vid 400 xgi och avlägsna supernatanten.
2. Resuspendera totalt splenocytes på 1 x 10 ⁶ / ml i IMDM + 10% FBS + 50 mm 2-merkaptoetanol + penicillin / streptomycin (komplett IMDM). Separata celler i två grupper, varav den ena är kompletteras med RA (eller syntetiska RAR-agonister, som Am80 eller Am580) till en slutlig koncentration på 100-200 Nm ^3. T-celler aktiveras i närvaro av RA eller RAR-agonister kommer upregulate a4b7and CCR9 och blir tarm-tropism T-celler, medan T-celler aktiveras utan RA blir styra T-celler.
3. Lägg till 1,5-2,0 mL av cellsuspensionen i varje brunn på en 24-brunnar tidigare belagda med anti-CD3 (10 mg / ml) och anti-CD28 (10 mg / ml) och inkubera vid 37 ° C i 5% CO ₂ (för beläggning på plattan 500 ml / brunn av anti-CD3 plus anti-CD28 i PBS och inkubera i 2 timmar vid 37 ˚ C och sedan tvätta två gånger med 2 ml PBS).
4. För att undvika att T-cell överstimulering, efter 2-3 dagar överföra cellsuspensioner i ett obestruket nya 24-brunnar. Inkubera i ytterligare 2-3 dagar. Beroende på cell-täthet och spridning i media kan bli surt (gul), i vilket fall kan det vara nödvändigt att ersätta hälften av media med färska komplett IMDM. Harvest cellerna efter 4-5 dagar (räknat från dag 0).
5. Typiska slutliga avkastningen är 1-2 x 10 ⁶ effektor T celler / brunn. Därför bör minst 9-12 brunnar för varje gut-tropism T-celler och kontroll T-celler vara klädd för att sluta med 10-20 x 10 ⁶ T-celler per tillstånd.

2. Analys av gut-målsökande receptorer på aktiverade T-celler

Efter 4-5 dagar av kulturen vi bör iaktta en hög uttryck för tarm-homing receptorer a4b7and CCR9 på T celler aktiveras i närvaro av RA eller RAR-agonister, medan kontroll T-celler bör uttrycka mycket låga nivåer av dessa receptorer ^4.

Flödescytometri (FACS) analys.

1. Samla mellan 0,2-0,5 x10 ⁶ celler och centrifugera i 5 min på 300 g vid 4 ° C.
2. Inkubera med anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) och anti-CD8-PercP i 15 minuter vid 4 ° C i mörker.
3. Efter inkubation centrifugeras i 5 min på 300 g 4 ° C. Tvätta och resuspendera cellerna i färgning buffert och analysera med FACS.

3. T-cell märkning med CFSE och CMTMR cell trackers

1. Håll alla lösningar vid 37 ° C före start. Tvätta gut-tropism T-celler (a4b7 ^Hög CCR9 ^Hög) och kontroll T-celler (a4b7 ^{Låg / Neg} CCR9 ^{Låg / Neg)} två gånger med PBS för att ta bort serum. Justera T cell koncentrationen till 10-15 x 10 ⁶ / ml i PBS.
2. Lägg CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) eller CMTMR (klormetyl-benzoyl-amino-tetramethylrhodamine) fluoroforer antingen gut-tropism T och kontroll T-celler till en slutlig koncentration av 5 mm och 10 mm respektive Vortexa försiktigt och inkubera i 20 minuter vid 37 ° C. Det rekommenderas att byta labelings i samma eller i ett separat experiment för att utesluta eventuella inneboende effekter fluoroforer på T cell migration.
3. Efter inkubation, släcka med en volym av FBS och inkubera i 1-5 minuter i rumstemperatur. Späd 10 gånger med varmt PBS och centrifugera i 5 minuter vid 300 g. Tvätta två gånger med PBS och återsuspendera i fullständig IMDM.
4. Helst ska 10-20 x 10 ⁶ celler på varje T befolkningen blandas i förhållandet 1:1 och sedan centrifugeras vid 300 xg under 5 minuter. Slutligen resuspendera cellerna i 200-250 ml varmt PBS och injicera via svansvenen.
5. För att beräkna den exakta indata-tal (idealiskt nära 1) spara 5-10 ml av den injicerade cellsuspensionen och späd med 300 ml PBS och analysera med FACS.

4. Analys av T-cell målsökande

Även möss kan analyseras vid olika tidpunkter (mellan 1 h och flera dagar efter T-cell injektion) är målsökande av tarmen-tropism T-celler bäst dokumenterade mellan 12-24 timmar efter injektion. Längre tidpunkter öka de potentiella effekterna av andra variabler som påverkar den slutliga cell nummer / nyckeltal, exempelvis T-cell apoptos och T-cell ut ur vävnaden. Efter att möss är dödshjälp, cellsuspensioner från flera vävnader bör isoleras utan dröjsmål för att minska celldöd, som kan påverka den slutliga avkastning och resultat. Vävnader av intresse är tunntarmen, tjocktarm, mjälte, lymfkörtlar, Peyers plack, lever, lungor och blod. Ominjiceras T-celler är seriösa gut-tropism T-celler, bör de hem i genomsnitt 5-10 gånger bättre (eller högre) till tunntarmen slemhinna jämfört med kontroll T-celler. Däremot bör andra vävnader såsom blod och mjälte, uppvisar inte en förmånlig migration T-cell. Isolering av lymfocyter från mag lamina propria och intraepitelial facket har tidigare beskrivits ^5.

1. FACS färgning: Prover återsuspenderad beroende på antalet celler som samlas in, med en täthet som inte är högre än 3,0 x 10 ⁶ celler / ml. Om congenic CD45.1 ⁺ eller Thy1.1 ⁺ möss användes som mottagare, är cellerna färgas med motsvarande congenic markör (t.ex. CD45.2 eller Thy1.2) i kombination med viss härstamning markör (t.ex. TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 ⁺ / CD45.2 ^+).
2. Under FACS analys celler är gated på congenic markör (t.ex. CD45.1) och sedan på de specifika härstamning markörer (t.ex. CD4/CD8) och analyseras för förhållandet mellan CMTMR och CFSE positiva celler.
3. Uppgifterna är oftast uttryckt som Homing Index (HI), som beräknas som kvoten CFSE / CMTMR (eller CMTMR / CFSE) i varje vävnad dividerat med motsvarande ingång förhållandet (se nedan). Om ingången förhållandet är väldigt nära 1, då vävnaden nyckeltal kommer att motsvara HI.

HI = CFSE _vävnad / CMTMR _vävnad: CFSE _in / CMTMR _ingång

Blod bör också analyseras för att avgöra om både T cellpopulationer är lika representerade i omlopp eller om en T-cell population minskar förhållande till andra (t.ex. genom förmånliga fångst i lungor / lever eller minskad lönsamhet). Detta kan inträffa när du jämför naiva eller vilande celler minne T kontra nyligen aktiverade effektor celler T, eftersom den senare kan vara instängd i större utsträckning i lungorna. Om HI i blodet är väsentligt annorlunda än 1, kan man normalisera HI i vävnader av HI i blod. Blod kan fås via hjärtat från möss sövda (med AVERTIN eller isofluorane före eutanasi) och bör lyseras två gånger med ACK buffert innan du använder den för FACS färgning.

Blod normalisering = HI _vävnad / HI _Blood

5. Representativa resultat

Mottagare möss (Thy1.1 ⁺⁾ var euthanized18h efter cell injektion. Cellsuspensioner genererades från mjälten, perifera lymfkörtlar (PLN), kröslymfknutor (MLN) och tunntarmen lamina Propia (LP). Efter att cellerna var färgas för Thy1.2 och CD8 och sedan analyseras av FACS genom gating på livskraftiga Thy1.2 ⁺ CD8 ⁺ celler, som slutligen analyserades för förhållandet mellan CMTMR ⁺ celler (gut-tropism T-celler) och CFSE ⁺ celler (kontroll T-celler) dividerat med ingång förhållandet. Resultaten kan visas som visas i figur 2, där det kan uppskattas att tarmen-tropism och kontroll T-celler homing såväl mjälten (HI nära till1, markerad med en röd linje). Däremot gut-tropism T-celler flyttade cirka 10 gånger effektivare på LP jämfört med kontroll T-celler.

Figur 1:. Diagram som visar produktion och märkning av tarm-tropism och icke-gut tropic celler T celler isolerade från vildtyp möss och aktiveras med anti-CD3/anti-CD28 och i närvaro eller frånvaro av 100-200 nM alla - trans-retinoinsyra (RA). Efter 4-5 dagar RA behandlades med T-cell förvärva uttrycket av tarmen målsökande receptorer CCR9 och a4b7. Sedan är gut-tropism och kontroll T-celler differentiellt märkta med CFSE eller CMTMR, tvättas, blandas i förhållandet 1:1 och injiceras i en mottagare mus via svansvenen. Vissa märkta celler används för att bestämma CFSE / CMTMR ingång förhållande (bör vara nära 1).

Figure2:. Exempel på målsökande analys Möss analyseras 12-18 timmar efter T-cell injektion och enda suspensioner celler erhålls från organ av intresse. Cellerna färgas med anti-Thy1.2 (congenic markör) samt anti-CD8 och sedan Thy1.2 ⁺ CD8 ⁺ T celler analyseras för förhållandet mellan CMTMR ⁺ och CFSE ⁺ celler i varje vävnad med FACS. Vävnaden CMTMR / CFSE nyckeltal sedan normaliseras av Input CMTMR / CFSE förhållandet att få returnera index (HI). I detta exempel CMTMR ⁺ och CFSE ⁺ celler gut-tropism och kontroll effektor celler T, respektive.

Discussion

Även om målsökande experiment ger mycket värdefull information om migration av totala cellpopulationer i en viss vävnad, bör man hålla i minnet att dessa analyser inte direkt analysera endotelceller vidhäftning och därför inte diskriminera på vilket steg (s) i flera steg vidhäftning kaskad (tethering / löpande, aktivering eller sticker) ett givet homing receptor agerar. Guldmyntfoten att definiera den särskilda roll som homing receptorer i vidhäftning Cascade är intravital mikroskopi (IVM) i vilka enskilda fluorescerande T-celler (eller andra celler eller till och med fluorescerande pärlor) direkt kan observeras interagera med endotelceller i realtid. Dock är IVM tidskrävande, kräver mus anestesi, innebär mödosam kirurgiska ingrepp och behov innan isolering av ett stort antal rena och homogena cellpopulationer för märkning och injektion. Dessutom har vissa vävnader, till exempel centrala nervsystemet (CNS) och bräss, är svåra att komma åt för IVM. Slutligen IVM förberedelser kräver vävnad immobilisering som är svår att uppnå i vissa organ / vävnader såsom lever, lungor och tarm (för en detaljerad diskussion om IVM se ref. ^6).

Å andra sidan, målsökande experiment är relativt enkelt att installera, de kan göras konkurrenskraftigt genom samtidig injicera två differentiellt märkta T-celler, och de tillåter samtidig behandling av flera vävnader / organ och populationer cell i ett enda experiment med FACS . På en konkurrensutsatt målsökande experiment syftet är att avgöra vad som är den relativa migration av en T-cell population förhållande till ett annat (differentiellt märkta) T-cell population i olika vävnader. Eftersom resultaten uttrycks som HI, behöver analyserna inte absolut celler och resultaten påverkas inte av antalet injicerade T-celler, med antalet isolerade / analyseras T-celler i varje vävnad eller genom att eventuella skillnader i djur / organ storlek.

Dessa fördelar trots bör man hålla i minnet att konkurrensen målsökande försök inte ge information om den verkliga omfattningen av T-cell migration i varje vävnad. I själva verket kan HI vara mycket missvisande i vävnader med mycket dålig T-cell migration och som väldigt få T-celler kan upptäckas med FACS, såsom i den icke-inflammerade tjocktarmen eller CNS (några T-cell händelser som kan tyda blodsmitta kan resultera i stora variationer i HI). Som en allmän regel bör HI endast användas när tillräckligt många händelser som upptäckts av FACS, så att åtminstone en av de märkt populationer T cell tydligt kan identifierade i en viss vävnad.

Slutligen bör konkurrenskraftig målsökande experiment och HI beräkningar helst kompletteras med absolut cell räkning av T-celler (vanligen uttryckt som antalet T-celler i en vävnad per 1 x 10 ⁶ injicerade totala T-celler). Men att bestämma absoluta antalet T-celler i varje vävnad är tidskrävande och dess tillförlitlighet / reproducerbarhet beror på noggranna injektionstekniken för att försäkra att de flesta T-celler injiceras intravenöst och på effektiv T-cell var för sig vävnad.

Sammanfattningsvis har vi beskrivit konkurrenskraftiga målsökande experiment mellan tarm-tropism och kontroll celler T. Dock kan denna metod tillämpas på många andra lymfoida celler (t.ex. naiva eller aktiverade T-och B-celler, T _REG, etc.) och även för icke-lymfoida celler (t ex DC, stamceller etc.). Således målsökande experiment ger ett enkelt, mångsidigt och kraftfullt verktyg för att studera cell migration in vivo.

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).