Summary
We zien in de video een methode voor het produceren van een midden cerebrale slagader occlusie bij volwassen muizen met behulp van een intraluminale monofilament. We laten ook zien hoe de omvang van herseninfarct beoordelen door 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) kleuring.
Abstract
Beroerte is de meest voorkomende dodelijke neurologische aandoening in de Verenigde Staten 1. De meerderheid van slagen (88%) het gevolg zijn van verstopping van de bloedvaten in de hersenen (ischemische beroerte) 2. Aangezien de meeste ischemische beroerte (~ 80%) zich voordoen op het grondgebied van de middelste cerebrale arterie (MCA) 3, hebben veel dieren takt modellen die zijn ontwikkeld gericht op deze slagader. De intraluminale monofilament model van de midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) behelst het inbrengen van een chirurgische filament in de externe halsslagader en threading deze naar voren in de interne halsslagader (ICA), totdat de tip afsluit de oorsprong van het MCA, wat resulteert in een stopzetting van de bloedstroom en de daaropvolgende herseninfarct in het MCA grondgebied 4. De techniek kan gebruikt worden om een permanente of tijdelijke occlusie 5 model. Als de hechting is verwijderd na een bepaalde interval (30 min, 1 uur of 2 uur), is reperfusie bereikt (van voorbijgaande aard MCAO), indien de gloeidraad blijft op zijn plaats (24 h) de procedure is geschikt als een model van permanente MCAO . Deze techniek vereist geen craniectomy, een neurochirurgische procedure om een deel van de schedel, die intracraniële druk en temperatuur 6 kunnen beïnvloeden te verwijderen. Het is uitgegroeid tot de meest gebruikte methode om permanente en voorbijgaande focale cerebrale ischemie na te bootsen bij ratten en muizen 7,8. Het evalueren van de mate van herseninfarct, we vlek hersenen plakjes met 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) om ischemisch hersenweefsel 9 te identificeren. In deze video, tonen we de MCAO methode en de bepaling van de grootte van het infarct door TTC kleuring.
Protocol
1. MCAO Methode
Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies bij UCSF en Kent State University, en houdt zich aan de National Institutes of Health richtlijnen voor het gebruik van proefdieren.
- Snijd een 5-0 monofilament hechtmateriaal (Harvard Apparatuur, Holliston, MA) in 20 mm segmenten. Rond het uiteinde van elk segment door het te verhitten bij een cauterizer (Braintree Scientific, Inc, Braintree, MA). Meet de diameter van de tip met behulp van een micrometer (Applied Image Inc, Rochester, NY). We maken gebruik van een hechtdraad met een laatste tip diameter van 0,21-0,22 mm voor een muis met een lichaamsgewicht van 25-30 g.
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten in autoclaaf (minimum 121 ° C, 15 PSI, gedurende 15 min). Ontsmetten van de operatie tafel en de bijbehorende apparatuur met 70% ethanol.
- Verdoven een 8-12 weken oude muizen (25-30 g) met 5% isofluraan (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) in 30% O 2 / 70% N 2 O met behulp van de V-10 Anesthesie-systeem (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). Na de inductie van de anesthesie, verminderen het niveau van de isofluraan en onderhouden op 1,5%.
- Plaats de muis in de rugligging op een verwarmingselement. Plaats een rectale sonde, en monitoren en onderhouden van de lichaamstemperatuur tussen de 36,5-37,5 ° C met behulp van de TR-200 homeothermic temperatuur systeem (Fine Science Tools Inc, Foster City, CA).
- Scheren van de vacht op de buik nek regio met tondeuse (Braintree Scientific) op de huid bloot te leggen. Desinfecteer de operatiewond met behulp van drie toepassingen van 70% ethanol.
- Onder een stereo-installatie dissectiemicroscoop (Nikon, Japan), maak een 1 cm lange middellijn incisie op de hals. Gebruik oprolmechanismen (Braintree Scientific) om het chirurgische veld bloot te leggen en het recht gemeenschappelijke halsslagader (CCA), externe halsslagader (ECA), en de interne halsslagader (ICA) te identificeren. Zorgvuldig ontleden de slagaders vrij uit de omliggende zenuwen en fascia.
- Ontleden van de Rekenkamer verder distaal en stollen de Europese Rekenkamer en zijn superieure schildklier slagader (STA) tak met behulp van een bipolaire coagulator (Howard Instrument Inc, Tuscaloosa, AL). Snijd de Rekenkamer en de STA aan de gestolde segment.
- Losjes gelijkspel 8-0 twee zijden hechtingen rond de Europese Rekenkamer stomp. Breng een vasculaire klem (Fine Science Tools) op de splitsing van de CCA in de Europese Rekenkamer en de ICA.
- Maak een kleine incisie aan het einde van de Europese Rekenkamer stronk met Vannas-stijl veer schaar (Fine Science Tools). Meet en noteer de lengte van een 5-0 monofilament hechting afgerond aan het uiteinde. Steek de hechting in de incisie en vooraf aan de klem. Draai de twee zijden hechtingen rond het lumen net genoeg om veilig maar toch behouden mobiliteit van de in-woning monofilament hechtmateriaal.
- Verwijder de klem van de bifurcatie. Voorzichtig vooraf het monofilament hechtdraad uit het lumen van de Europese Rekenkamer in de ICA over een afstand van 9-10 mm voorbij de splitsing van CCA om de oorsprong van MCA af te sluiten. De duur van de operatie is ongeveer 30-45 minuten.
- Suture de incisie op de hals en zet de muis in een 35 ° C verpleging box om te herstellen van anesthesie, en terug in de kooi. Het duurt over het algemeen 5-10 min voor de muizen om te herstellen van anesthesie. Voor het uitvoeren van voorbijgaande MCAO, kan de onderzoeker opnieuw verdoven met de muis en terug te trekken van de hechting in de stronk van de Europese Rekenkamer na een periode van tijd, meestal tussen de 0,5-2 uur
- Vierentwintig uur na de inductie van MCAO, verdoven van de muis met 5% isofluraan en euthanaseren door cervicale dislocatie. Onthoofden de muis en het verzamelen van de hersenen. Coronaalwaarts Snijd de hersenen in vier 2-mm schijven met een brein matrix (Braintree Scientific) op ijs. Incubeer de hersenen plakjes in 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) (Sigma-Aldrich) in 1X PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur om de grootte en de omvang van het infarct te bepalen. Bevestig de hersenen plakjes in 10% neutraal formaline oplossing (Sigma-Aldrich) gebufferde bij 4 ° C tot beeldvorming. De mate van infarct kan worden gekwantificeerd, zoals beschreven in Jupiter-protocol 955 ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9.
2. Representatieve resultaten
De infarcten gegenereerd door MCAO worden gezien in het striatum en de dorsolaterale cortex. Het striatum is meer gevoelig voor ischemie dan de cerebrale cortex. Dertig minuten van MCAO zal produceren een infarct alleen in het striatum, terwijl meer dan een uur van de MCAO zal zowel striatum en cortex schade. Na 24 uur permanent MCAO, het totale percentage infarct is ~ 40 ± 5% van het halfrond en de mortaliteit na de operatie is ~ 10%. We sluiten muizen van verdere studies of overmatig bloeden optreedt tijdens de operatie, de operatie tijd 90 min overschrijdt, muizen niet om te herstellen van anesthesie binnen 15 min, of bloeding is gevonden in de hersenen schijfjes of aan de basis van de cirkel van Willis tijdens de post mortem onderzoek .
61/2761fig1.jpg "alt =" Afbeelding 1 "/>
Figuur 1. Representatieve beelden van TTC-gekleurde hersenen plakjes (coronale niveau 1-4) na 24 uur van permanente MCAO. In levend weefsel TTC wordt enzymatisch verminderd door dehydrogenases aan 1,3,5-triphenylformazan (TPF), dat is rood van kleur, terwijl het in necrotische gebieden blijft wit door het ontbreken van een dergelijke enzymatische activiteit. Daarom kan het gebied van het infarct worden geïdentificeerd door zijn witte kleur door een gebrek aan omzetting van TTC aan TPF. Let op: TTC is een beetje warmte en licht onstabiel dus bescherm gekleurde coupes van warmte en licht zoveel mogelijk.
Discussion
MCAO in muizen wordt vaak gebruikt om de hersenen focale ischemie model bij de mens. Het gebruik van muizen voor een beroerte studies is steeds vaker als gevolg van de beschikbaarheid van transgene en knock-out stammen. Er zijn een paar kritische details op te merken in het protocol:
- Het is essentieel om de muis te lichaamstemperatuur te handhaven tijdens de operatie en voordat hij volledig is hersteld van de anesthesie. Lichaamstemperatuur heeft effecten op de omvang van de infarct; onderkoeling af en hyperthermie neemt de grootte van het infarct.
- Terwijl bloot en het isoleren van de CCA en de Rekenkamer, om schade aan de nabijgelegen nervus vagus en de luchtpijp, die infarctgrootte en afname van levensvatbaarheid zou kunnen toenemen.
- Steek de monofilament hechtmateriaal meer dan 10 mm voorbij de bifurcatie. Een hechting te ver ingebracht kunnen perforeren de voorste cerebrale slagader en resulteren in een hersenbloeding. Een weerstand kan worden gevoeld als de hechting is geavanceerde ongeveer 9-10 mm voorbij het bifurcatiepunt. Als dit gebeurt, moet de onderzoeker te stoppen bevorderen van de hechting en bevestig de afstand.
Disclosures
We hebben geen mogelijke tegenstrijdige belangen te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie NS057195, UCSF REAC award, en Kent State University start-up fonds WH Chou.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Chemical | Baxter Internationl Inc. | 95045-588 | |
| V-10 Anesthesia system | Equipment | VetEquip | 901807 | |
| TR-200 Temp Controller | Equipment | Fine Science Tools | 21060 | |
| Electric clipper | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | CLP-9931 | |
| Dissecting microscope | Equipment | Nikon Instruments | SMZ745T | |
| Retractor system | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | ACD-014 | |
| Bipolar coagulator | Equipment | Howard Instrument | 64000 | |
| Silk suture | Material | Harvard Apparatus | 510479 | |
| Monofilament suture | Material | Harvard Apparatus | 723351 | |
| Vascular clamp | Equipment | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Vannas scissor | Equipment | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Brain matrix | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | BS-2000C | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Chemical | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| 10% neutral buffer formalin | Chemical | Sigma-Aldrich | HT5011 |
References
- Howard, G., Howard, V. J. Distribution of stroke: hetrogeneity of stroke by age, and sex. , Elsevier Inc. New York. 3-12 (2004).
- Thom, T. Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 113, e85-e151 (2006).
- Mohr, J. P. Middle cerebral artery disease. , Elsevier Inc. New York. 123-166 (2004).
- Longa, E. Z. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Chou, W. H. Neutrophil protein kinase Cdelta as a mediator of stroke-reperfusion injury. J. Clin. Invest. 114, 49-56 (2004).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. The effect of electrocautery, atmospheric exposure, and surgical retraction on the permeability of the blood-brain-barrier. Stroke. 1, 375-380 (1970).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
- Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. , (2008).
