Summary
Острое повреждение почек (АКИ) в организме человека является распространенной клинической проблемой вызвано повреждением эпителиальных клеток, которые составляют почки нефронов, и AKI связано с высокими показателями смертности на 50-70%
Protocol
1. Микроинъекция процедуры для обозначения данио предпочки проксимальных канальцах эпителий
Для этой процедуры мы используем микроинъекции системы (Гарвардский Appartus, PLI90), под давлением воздуха, подаваемого компрессором (Jun-Air, модель 6-4), и микроманипулятора аппарата (Narishege части MN151, IP3 и GJI), которые собрались в стереомикроскопа станции (Nikon, СМЗ-Zoom 645) в соответствии с инструкциями производителя. Декстран конъюгатов легко эндоцитарных от проксимальных канальцах нефрона, что позволяет льготных маркировки этой популяции клеток эпителия 9.
- Контакт с метиленовым синим может подчеркнуть аутофлюоресценция желточного мешка и делает визуализацию нефрона канальцев сложнее.
- Поднимите оплодотворенных эмбрионов на 28,5 ° С до развития timepoint между 48-55 часов после оплодотворения (HPF). Это идеальная сцена для выполнения личинки микроинъекции из-за легкости, при котором внутримышечного микроинъекции может быть выполнена, и из-за функцией почек начинается в это время.
- Удалить хориона с любого невылупившиеся данио с помощью пары тонких щипцов. Промыть хориона мусора из чашки Петри и залить блюдо с 30 мл модифицированной E3 решение.
- Подготовка инъекций лоток для эмбрионов. Мы предпочитаем форм инъекций производится в размере 1,5% agarose/E3, в котором треугольные впадины образуются, что эмбрион может располагаться внутри для инъекций. Для того, чтобы литья под давлением, мы плавают пластиковые формы с клиновидной формы выступы (подробно описано ранее 11) в чашке Петри заполнены базы на 1,5% агарозы.
- Подготовка иглы стекла микроинъекции, потянув капиллярные трубки с иглой съемник, как описано в данио рерио 10 книг. Короче говоря, тянуть стеклянные капилляры затем с помощью тонкой щипцов металл, чтобы сократить кончик иглы микроинъекции, чтобы сделать кончик острия во время просмотра иглы под стереомикроскопа. Магазин сократить иглы покрыты в чашке Петри и позиционируется на пластилин для защиты отреза и предотвращают накопление пыли.
- Подготовка раствора для инъекций для маркировки проксимальных канальцах. Растворите 40 кДа декстран-флуоресцеина сопряжены (Invitrogen, D1845) при концентрации 1 мг / мл в дистиллированной воде.
- Для обезболивания рыбы, добавляют 5 мл 0,2% Tricaine рН 7,0 до чашке Петри содержащих личинки данио в 30 мл Е3. Рыба под наркозом, когда они больше не обладают чувствительностью к касанию. Очень важно, чтобы рыба полностью под наркозом или они будут дергаться при попытке внедрить их.
- Передача под наркозом рыбу лоток литья под давлением с использованием пластиковой пипетки передачи. Позиция животное с головой в самую глубокую часть треугольного депрессии хорошо, и на его стороне, что ствол отдыхает по угловым стороне хорошо.
- Выполните внутримышечного микроинъекции. Нагрузка вырезать иглой с 2-3 мкл декстран флуоресцеин, и ввести животное в багажник сомитов с примерно 1 NL решения. Стремитесь к верхней части сомитов, и избежать расширения желточного мешка. Это гарантирует, что канальцы нефрона не механически нарушены микроинъекции процесса.
- Передача вводят данио в чистую чашку Петри, и добавить модифицированный E3 решение. Промыть животных 3 раза со свежими E3, чтобы удалить все следы Tricaine. Обложка крышку чашки Петри с алюминиевой фольгой, чтобы обеспечить световых защиты декстран, и вернуть животных на 28 ° C инкубаторе на ночь.
2. Целевые лазерной абляции проксимальных канальцах клетки
Для этой процедуры мы используем стереомикроскопа с epifluorescence забивать животных с декстран флуоресцеина ярко меченных проксимальных канальцах и выбирать их для лазерной абляции. Затем, мы используем импульсный лазерной системы микроострие (Фотонные Instruments, Inc), который был присоединен к сложного микроскопа (Nikon Eclipse 80i с epifluorescent вложение), и откалиброван для использования в соответствии с инструкциями производителя, для выполнения нефрона ячейки абляции. Мы имели наибольший успех в ячейке абляции с помощью FITC фильтр, который позволяет исследователю, чтобы посмотреть флуоресцентные регионах трубочку под светлое освещение.
В преддверии этой процедуры, подготовить иммобилизации средств массовой информации для абляции путем растворения 1,5% метилцеллюлозы в 0,02% tricaine/E3. Магазин аликвоты метилцеллюлозы для немедленного использования при комнатной температуре или при температуре 4 ° С в течение длительного хранения.
- Обезболить 72 данио ФВЧ путем добавления 5 мл 0,2% 7,0 рН Tricaine в чашке Петри содержащих личинки данио в 30 мл Е3. Рыба под наркозом, когда они больше не обладают чувствительностью к касанию. Очень важно, чтобы рыба полностью под наркозом или они будут дергаться при попытке выполнения лазерной абляции. Изучить вводили животным под соответствующим люминесцентные настройки и выбрать животных, в которых вы можете легко визуализировать проксимальных канальцев.
- Передача выбранного эмбрионов отдельное блюдо содержащих tricaine. Животные могут быть под наркозом в течение 30 минут, прежде чем выполнять ячейка абляции. Если вы набрали> 15 животных, возвращение их на отдельное блюдо со свежими изменение E3 в ожидании абляции, как каждая клетка абляции занимает несколько минут.
- Чтобы выполнить удаление, передачу один наркоз данио в небольшой чашке Петри, содержащий 1,5% methylcellulose/0.02% tricaine в течение 2 минут, чтобы вымыть эмбриона в иммобилизации средств массовой информации.
- Далее, передача эмбриона предметное стекло депрессии содержащие капли 1,5% methylcellulose/0.02% tricaine. Аккуратно положение животного с тонкой зонд такая, что ее брюшной стороне лица слайдов и спинной стороной вверх.
- Место скользить по compund столик микроскопа, и сосредоточиться на спинной стороне животного. Выполните удаление нефрона клетки под фокус путем нажатия педали. Вы увидите, разгон флуоресценции как почечных эпителиальных клеток удаленной (рис. 1А).
- Аккуратно передачи удаленной животное хорошо в 12 хорошо блюдо для последующего культивирования. Промыть E3 2-3 раза, чтобы смыть метилцеллюлозы.
- После инъекции, повышение животное желаемый timepoint и выполнять желаемые анализ в установленном гистологических и молекулярных методов для молодых эмбрионов данио рерио (рис. 2).
3. Представитель результаты:
Данных, которые показаны на рисунке 1 показывают абляции timecourse. После внутримышечной инъекции с декстран-конъюгаты, проксимальных канальцах предпочтительно маркированы. Введение декстрана-FITC был использован для обозначения почки для лазерной абляции и удаленной животных закачиваемый с декстран-родамин на один дополнительный timepoint следующие абляции Reimage проксимальных канальцах населения. Выражение методы анализа, например в гибридизация может быть использована для анализа изменений в основной образцов при одном timepoints следующие ячейки абляции, как показано на рисунке 2.
Рисунок 1: Процедура лазерной абляции сопровождается быстрой регенерации эпителия канальца (AC) Timecourse клеточных изменений во время и после лазерной абляции данио личинки проксимальных канальцах во время абляции (3-й день, панели), или один или три. дней после абляции (4-й день, панель B; день 7, панель C). (Вверху) схемы показывают положение нефрона, с декстран-FITC (зеленый) и декстран-родамин (красный), и (внизу) изображения в реальном времени контроля и лазерной абляции (LA) нефронов.
Рисунок 2:. Анализ экспрессии генов следующим лазерной абляции После лазерной абляции на 3-й день, эмбрионы были зафиксированы и обработаны все монтировать на месте гибридизации для обнаружения стенограммы slc20a1a, которые отмечают проксимальных извитых канальцах сегменте нефрона. (А) контроль эмбрион, который не был подвергнут лазерной абляции, (B) эмбрион, в котором большой участок эпителия канальцев удалена, и (C) эмбрион, в котором короткий промежуток канальцах эпителий абляции. Черная линия показывает степень в проксимальных канальцах предоставить ссылки, синие линии показывают степень лазерной абляции в панели до н.э., а * обозначает контроль (не удаленной) контралатеральной нефрона в панелях до нашей эры.
Discussion
Данио является широко используемой моделью организма на протяжении многих областях науки, применение которых растут 6. Применение системы данио модели в исследовании почечных заболеваний, как AKI привело к важным наблюдениям и будет продолжать быть хорошей моделью для изучения почки 7,8. С генома, которая была последовательной и многие молекулярные протоколов на месте, она становится все более легко выполнять сложные исследования данио, которая использует трансгенных моделей, генной нокдаун и misexpression исследований. Данио имеет короткий жизненный цикл с большими размерами поколения и четко определенных стадиях развития. Кроме того, данио эмбриональных и личиночной стадии в значительной степени прозрачным, что делает изображение исследования невозможны без рассечения организма. На протяжении эмбриональной и личиночной стадии, данио имеет pronephric почки состоит из двух нефронов, которые остаются видимыми в течение этих timepoints развития. Данио рерио pronephric нефронов аналогичны по структуре и функции с их коллегами млекопитающих, что делает его хорошей моделью для исследования острой почечной недостаточность 4,5.
Почка имеет решающее значение для выживания человека и других позвоночных, выступающей в качестве органа, который очищает организм от жидких отходов метаболизма. Это очищение функция опирается на способность почек нефронов для фильтрации крови, а затем изменить для сбора фильтрата азотистые отходы для секреции и одновременно поддерживать водно-солевой баланс. Нефронов состоят из крови фильтр, эпителиальные трубочки, и впадают в проток. Структурную и функциональную целостность всех трех частей является неотъемлемой частью нефрона функции. Различные оскорбления в почках, в том числе воздействия нефротоксины, ишемия, или обструкции мочевыводящих путей оттока может привести к AKI 1. Патология AKI часто ассоциируется с острым трубчатых 1,2 некроза. Клинические исследования показали, что возникающее в результате почечной недостаточности, смертность, которая может варьироваться от 7-80% в зависимости от причины и контекст почечной недостаточности. Тем не менее, экспресс-диагностики и изменение основной причиной AKI все чаще ассоциируется с восстановлением через регенерацию некротических канальцах нефрона. Недавние исследования отображение судьбы показали, что основные популяции клеток, которые повторно заполняет поврежденные канальцы нефрона являются эпителиальные клетки, которые происходят из соседних, неповрежденных областях 12. Эти выводы не исключают возможность, что почечная стволовых / прогениторных клеток, может участвовать в процессе, и независимые отчеты показали, что костный мозг клеток, полученных может способствовать почечной регенерации 13. Ясно, что продолжение исследования, чтобы лучше решать сотовой источников почечных эпителиальных регенерации.
Оба регенерации нефрона и развития доли явление переключателей в сотовых состояние между мезенхимальные и эпителиальные фенотипы. В процессе разработки нефрона, мезенхимальных клеток-предшественников дифференцироваться в стационарных фенотип, подключение к базальной мембраны для формирования трубчатого эпителия 3. Предположил феномена миграции эпителиальных клеток после острой почечной недостаточности требует дедифференцировки в мезенхимальных фенотипа. Интересно, что последние исследования показывают, что мезенхимальных клеток в поврежденных почках выставку выражение профиль похожа на мезенхимальные клетки во время развития 14. Различные отчеты обнаружили изменений в клеточных молекул адгезии, матричные протеины, цитокинов и хемокинов. После предлагаемой мезенхимальных в эпителиальных перехода, клетки собрать на базальной мембране и возобновить трубчатых эпителиальных деятельности. Определение генов важна в этом процессе по-прежнему является темой исследований нашей лаборатории и другие. Большая часть работы, чтобы выяснить ключевых факторов в этом процессе еще предстоит сделать, но значительного прогресса в области была объявлена по изучению последствий гентамицин.
AKI и почечной недостаточности, вызванной гентамицин актуальна учитывая распространенность нефротоксических соединения, применяемые в медицине 15. Используется для лечения грам-отрицательных бактериальных инфекций, администрация аминогликозидов приводит к острой травмы в 10-25% случаев. Препарат вызывает множество отрицательных клеточные эффекты, а также в результате апоптоза или некроза во многих трубчатых клеток. Исследования показали препарата связываются преимущественно с комплекс, образованный megalin и cubulin, которая участвует в эндоцитоза. Эти молекулы можно найти в изобилии в эпителиальных клетках проксимальных канальцах, хотя они не ограничиваются выражением в этих клетках. Через сотовой сигнализации в результате индукции окислительного стресса, выпуск вазоконстрикторов, истощение клеточных АТФ, гипоксия, угнетение фосфолипаз, гентамицин и аналогичные антибиотики вызываютапоптоза и некроза в эпителиальных клетках. Кроме того, антибиотики вызвать мезангиальных спад в крови нефрона фильтр (клубочки), что приводит к падению скорости клубочковой фильтрации и отрицательно меняют способность почки для фильтрации крови. Производство активных форм кислорода, иммуностимулирующие молекул, и активация фосфолипаз имеют диффузные эффекты в нефрона, создавая катастрофические патологии, что приводит к острой почечной недостаточности.
Хотя гентамицин и подобные антибиотикам исследования были и продолжают оставаться важными инструментами для исследования почек регенерации, им не хватает точности, которые могут быть полезны в решении некоторых вопросов. Наша система использования данио в сочетании с методом лазерной абляции, описанные в этом протоколе ответы нуждаются в такой точный инструмент исследования. Лазерной абляции позволяет исследователям, чтобы вызвать разрушение клеток в ключевых областях деятельности почечных канальцев, начиная от небольших (2-3) и крупных (> 50-100) населения, с непревзойденной точностью. В этом протоколе, мы используем ранее разработанный метод воздействия декстран-сопряженных с преимущественно этикетке проксимальных канальцах эпителиальных населения. Кроме того, трансгенные линии данио, которые выражают зеленого флуоресцентного белка в одном или нескольких регионах трубочка может быть использовано. Например, cadherin17: EGFP трансгенных данио проявляют сильное флуоресценции в дистальных отделах канальцев (хотя и слаб в проксимальных групп населения), и может быть полезен для изучения регенерации в других сегментах канальцев 16. Видимость нефрона позволит замедленной видеозаписи клеточные изменения с течением времени. В сочетании с генной экспрессии исследования, такие как целые горы на месте гибридизации или иммуногистохимии, исследователи могут обнаружить молекулярные изменения в нефрона с течением времени. Взятые вместе, эти стратегии могут приступить к разработке более динамичным понимание событий, которые испаряют при почечных эпителиальных клеток, уничтожаются.
Основные предостережение нашей модели лазерной абляции в том, что оно может резюмировать частичные аспекты физиологических условиях, что происходить в человеческом AKI. Индуцированной гибели клеток путем мгновенного физического ущерба отличается от каскад событий, который приводит к некрозу клеток, и как таковой гуморальных факторов в этих различных микросреды не могут быть идентичными. Кроме того, существует свидетельство апоптоз в почки, и неизвестно, будет ли такие последствия происходить следующее оскорбление с помощью лазера. Однако, как культура клеток является инструментом, который лучше отвечает на некоторые вопросы, которые требуют высокой контролируемой среде, лазерная абляция будет служить строго контролируемых в естественных условиях модель AKI. Таким образом, идеи почерпнуты из почечных эпителиальных исследования абляции в данио, скорее всего, способствовать открытию фундаментальной идеи, которые могут быть применены к исследованию других почечных травм и, возможно, используется для создания лучшей диагностики у людей.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим членов лаборатории Wingert за полезные обсуждения AKI биологии и данио методов и С. Дьеп для обмена его метилцеллюлозы рецепт. Авторы также хотели бы выразить нашу благодарность сотрудникам Нотр-Дам Центр исследований данио рерио за предоставление отличной постоянного ухода хозяйства для нашей данио колонии. Финансирование из NIH-NIDDK гранта до DK083512, и щедрый лаборатории начального финансирования из Университета Нотр-Дам, при поддержке этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo dishes | Falcon BD | 35-1005 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Injection needles | Sutter Instrument Co. | BF100-50-10 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 | |
| Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 204, 13-711-23 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| Depression slide | Fisher Scientific | S175201 | |
| 12-well dish | Corning | 3512 |
References
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).
- Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).
- Cosentino, C. ianciolo, Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).
- Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4657 (1998).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 3rd ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).
- Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. Contribution of stem cells to kidney repair. Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).
- Devarajan, P. Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kid. Int. , (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
