Summary
Una varietà di fattori di crescita e proteine interagiscono per indurre le cellule ad assumere diversi destini delle cellule durante lo sviluppo. Qui mostriamo l'uso di un ovo in preparazione per affrontare le possibili interazioni tra proteine diverse nello sviluppo, ponendo le perle di E2.5 embrioni di pollo.
Abstract
Il tubo neurale esprime molte proteine in specifici modelli di spazio-temporale durante lo sviluppo. Queste proteine hanno dimostrato di essere critica per la determinazione del fato cellulare, la migrazione delle cellule e la formazione dei circuiti neurali. Induzione neuronale e patterning coinvolgere proteina morfogenetica dell'osso (BMP), Sonic hedgehog (SHH), fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), tra gli altri. In particolare, il pattern di espressione di Fgf8 è in prossimità di regioni che esprimono BMP4 e SHH. Questo pattern di espressione è coerente con le interazioni di sviluppo che facilitano patterning nel telencefalo.
Qui forniamo una dimostrazione visiva di un metodo in cui un ovo in preparazione può essere usato per testare gli effetti del fgfs nella formazione del prosencefalo. Perle sono rivestiti con proteine e messo nel tubo neurale sviluppo per fornire l'esposizione prolungata. Poiché la procedura utilizza piccoli, perline accuratamente posizionati, è minimamente invasivo e permette sfere diverse da collocare all'interno di un unico tubo neurale. Inoltre, il metodo permette di sviluppo in modo che gli embrioni possono essere analizzati in una fase più matura per rilevare i cambiamenti di anatomia e di patterning neurale. Questo protocollo permette di semplice ma utile per l'imaging in tempo reale. Esso fornisce un mezzo per rendere spazialmente e temporalmente limitate modifiche a livelli di proteine endogene.
Protocol
1. Rimuovere le uova dal incubatore
A E2-2.5 (~ S. 17 HH), togliere le uova e preparare di conseguenza. Possono essere lavorato immediatamente o restituite al incubatore per un paio d'ore. Le uova possono essere messi a temperatura ambiente sicuro per più di un'ora. Uova possono rimanere fuori per tutta la durata delle manipolazioni. A volte questi può richiedere un'ora o più.
Nota: il più a lungo a temperatura ambiente, meno è probabile che per sopravvivere.
2. Preparazione di china
- Preparare una soluzione fresca del 4% di inchiostro in India nel PBS sterile.
- Riempire una siringa da 3 ml con la soluzione.
- Mettere un calibro 27, ago ½ pollice sulla siringa.
- Usando un paio di hemostats, piegare l'ago a un angolo di 90 °.
3. Aprendo le uova e l'iniezione di inchiostro di china
- Usando un paio di pinze, buccia indietro il nastro e aprire la finestra, fissandolo utilizzando il retro del nastro sulla parte posteriore dell'uovo.
- Guida l'ago inclinato fino a quando non si trova appena sotto l'embrione. Ponendo l'ago sotto il disco flottante assicura che l'inchiostro, che è tossico per l'embrione, non verranno in contatto diretto.
- Che devono essere iniettate solo inchiostro sufficiente per creare un contrasto confortevole. Questo è in genere meno di ¼ ml.
4. Apertura del tubo neurale
- Prendete un paio di forbici dissezione fine e tagliare la sottile membrana che si trova sulla parte superiore, o, talvolta, in giro, l'embrione.
- Prendete una coppia di 55 forcipe o una sonda di tungsteno e aprire il tubo neurale dal anteriore a posteriore. Assicurarsi che l'apertura è grande abbastanza per mettere un tallone in esso.
Nota: A seconda dell'età, una sonda di tungsteno multa può essere usato per fare la stessa cosa.
5. Recupero di un rivestimento acrilico eparina-perla
- Utilizzando una coppia di 55 pinze, trovare un intatto cordone nella soluzione. Lasciare che il cordone si attacca alla punta, chiudere lentamente la pinza.
- Rimuovere il tallone dalla soluzione e portare sopra sopra l'uovo.
- Una volta che il tallone è fuori della sua soluzione, non sarà probabilmente venire fuori fino a quando non è stato messo in albumina.
6. Ponendo il tallone
- Una volta che il tallone è stata posta sulla parte superiore dell'area di destinazione, utilizzare una sonda di tungsteno per guidarlo verso il prosencefalo o risolvere il problema nel romboencefalo.
- Aggiungere qualche goccia di PBS usando una pipetta 10 L.
7. Chiusura l'uovo
- Chiudere l'uovo con il sottile pezzo di nastro adesivo per chiudere la finestra.
- Tenuta l'uovo secondo il protocollo durante la preparazione, disponibile all'indirizzo http://jove.com/index/Details.stp?ID=306 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A seconda delle proteine che si desidera utilizzare, ci sono diversi protocolli su come preparare le perline. In questi esperimenti, si usa eparina-acrilico perline, ma affi-gel sfere possono anche essere utilizzati. Abbiamo scoperto che l'eparina-acrilico perle sono più facili da manipolare in ambiente acquoso del ovoalbumina. Le perline vengono immersi in 5 l di proteine durante la notte a 4 ° C. Microsfere di controllo sono posti in PBS sterile fino al momento del collocamento. Il vantaggio nell'utilizzo di uno in preparazione ovo è che l'embrione è ancora vivo e libero di svilupparsi normalmente 1. Anche se l'ambiente in cui è conservato un espianto può essere controllato per le variabili particolare, l'embrione vivo consente una rappresentazione accurata di l'effetto di una proteina presente sulla schemi evolutivi 2-3. Tutti i test che è possibile eseguire su un espianto, è possibile con un embrione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
