ここでは、走化性を調査するための詳細な生細胞イメージングの方法を説明します。我々は、遊走細胞のシグナル伝達事象の時空間ダイナミクスを監視するために蛍光顕微鏡の方法を提示する。シグナル伝達イベントの測定は、私たちはさらにGPCRシグナリングネットワークは真核細胞の化学誘引物質とコントロールの方向マイグレーションの勾配のセンシングを実現する方法を理解することが可能。
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この記事について
サマリー
要約
多くの真核細胞は、その環境での化学信号の勾配を検出し、それに応じて1を移行することができます。このガイド付きの細胞遊走は、免疫細胞や神経細胞2、3のパターニングの人身売買など、その機能を遂行するために様々な細胞に不可欠な走化性、と呼ばれます。 G -タンパク質共役受容体（GPCR）の大家族は、in vivoで 4 の細胞移動を指示するために、ケモカインとして知られている変数の小さなペプチドを、検出する。走化性研究の最終目標は、GPCRの機械感覚のケモカインの勾配とコントロールが走化性につながるイベントを通知する方法を理解することです。この目的のために、我々は、リアルタイムで、化学誘引物質の勾配に誘引物質、細胞運動の時空間濃度を監視するためのイメージング技術を使って、GPCRは三量体G -タンパク質の活性化を仲介し、5月8日真核細胞の走化性に関与する細胞内シグナル伝達イベント。単純な真核生物、 キイロタマホコリカビは 、白血球のに似ているchemotaxic動作を表示し、D.カビは真核生物の化学走性を研究するための重要なモデル系である。自由生活アメーバ、D.などdiscoideumの細胞が豊富な培地で割ります。飢餓時には、細胞は、multicullular構造を形成するためにcAMPを介した走化性を介して集約した発生プログラムを入力してください。 cAMPに走化性に関与する多くのコンポーネントは、Dで確認されているカビ 。 GPCR（CAR1）へのcAMPの結合はGγとGβγサブユニット7、9、10にヘテロ三量体G -タンパク質の解離を誘導する。 Gβγサブユニットは、順番に細胞膜11-13 PIP 3にPIP 2を変換し、PI3Kを活性化Rasを活性化する。 PIP 3はこのように膜14、15にこれらのタンパク質を募集し、プレクストリン相同（PH）ドメインを持つタンパク質の結合部位として機能する。 CAR1受容体の活性化はまた、PIP 2 16、17にPIP 3を脱リン酸化PTEN、の膜の関連付けを制御します。分子メカニズムは、進化的にそのような好中球18のようなヒト細胞のケモカインGPCRを介した走化性で保存されている。我々は、D.の走化性を研究するための次の方法を提示discoideumの細胞 。 1。走化性成分の細胞の調製。 2。 cAMPの勾配における細胞のイメージングは、走化性。 3。単一の生細胞におけるGタンパク質ヘテロのGPCR誘導活性を監視する。 4。リアルタイムで単一の生細胞のイメージングは、化学誘引物質トリガダイナミックPIP 3の応答。私たちの開発した撮像法は、ヒト白血球の走化性を研究するために適用することができます。
プロトコル
1。 キイロタマホコリカビの走コンピテントセルの調製
- 化学誘引物質cAMPに走ているD. discoideumの細胞、22で振とう培養からD3 - Tリッチメディアに成長して収穫の細胞を生成するには℃、
- （DBバッファは5mMのNa 2 HPO 4、5mMのKH 2 PO 4、2mMのMgCl 2、及び0.1mMのCaCl 2を含む）非栄養発達バッファーで細胞を2回洗浄する。
- 2 × 10 7細胞/ mlの密度でDBのバッファーで細胞を再懸濁する。
- 一時間では22で100回転℃で250mlのフラスコに10ミリリットルのセルを横に振る。
- 75 nMのcAMPの最終濃度、cAMPの脈打つ治療として指定されたプロセスを達成するために6時間以上6分毎に10ミリリットルの細胞を7.5μMのcAMPの株式の100μlを提供します。 cAMPのパルスの治療、D.の5-6時間後にdiscoideumの細胞は、cAMPの勾配に向かって有能な走化性となる。
- 5分の200 gで遠心分離により細胞を収集し、DBバッファと再懸濁し、細胞は、2.5 mMのカフェインを含む、22で200 rpmで振とう℃で20分間走の状況にセルをbasol....
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ディスカッション
細胞の走化性有能な段階に到達するプロセス
野生型のためのD. discoideumの細胞 、それは細胞がうまく偏光細胞形態と迅速な細胞の遊走（図1）が表示される間も、走化性有能な段階にそれらを誘導するために、室温で開発をパルス〜5約6時間かかります。このようなcAMPのパルスの濃度、温度、および異なる遺伝的背景など、いくつかの要因は、走化性有能なステージに到達する過程に影響を与える可能性があります。 cAMPの勾配は、細胞はcAMPのソース、走化性として指定された指示細胞の遊走に向かって移動して説明します。偏光形態と迅速な細胞運動：しかし、不十分な開発やそれらの遺伝的背景に起因する走有能な段階に達していない細胞は、2つの典型的な機能は表示されない場合があります。一方、原因過度な開発の走有能な段階を通過した細胞は、しばしばイメージング実験のために個々の細胞に分離することが非常に困難な細胞の塊を形成し、..
1。イメージングが表示され、操作可能な化学誘引物質の勾配で細胞をchemotaxing
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、NIAID、NIHから学内資金でサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| D3 - Tの増殖培地 | KDメディカル | ||
| カフェイン | シグマ | ||
| Latrunculin B | 分子プローブ | ||
| アレクサ594 | 分子プローブ | ||
| cAMPの | シグマ | ||
| ChronTrol XTプログラマブルタイマ | ChronTrolコーポレーション | ||
| Miniplus 3蠕動ポンプ | Gilbson | ||
| プラットフォームロータリーシェーカー | |||
| FemtoJetマイクロキャピラリー圧力供給 | エッペンドルフ | ||
| シングル四ウェルのLab - Tek社IIカバーガラスチャンバー | Nalgeヌンクインターナショナル | ||
| LSM 510 METAまたは同等の蛍光顕微鏡 | ツァイス | 40X 1.3 NAまたは60X 1.4 NA油DICプラン- Neofluarの対物レンズ | |
| オリンパスX81または同等の | オリンポス | 100X 1.47 NA TIRF対物レンズが必要です。 |
参考文献
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N.
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再版と許可
