Summary
Protocol
- विरोधी - CD4 + biotinlayted सतह के साथ microfluidic चैनल तैयार है.
- 5 मिलीलीटर / मिनट में नमूना रक्त के 10 मिलीलीटर सिरिंज पंप के साथ microfluidic चैनल में इंजेक्षन.
- पीबीएस के साथ 20 मिनट के लिए / 20 मिलीलीटर मिनट पर खून फ्लश.
- 5ul/min पर 15 मिनट के लिए पतला FACS lysing समाधान (पीबीएस साथ शेयर समाधान से 10% करने के लिए पतला) इंजेक्षन.
- 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- 5 मिलीलीटर / 20 मिनट के लिए मिनट पर प्राथमिक CD3 + एंटीबॉडी समाधान (पीबीएस साथ शेयर समाधान से 10% करने के लिए पतला) इंजेक्षन.
- 2 घंटे के लिए सेते हैं.
- 5 मिलीग्राम / 15 मिनट के लिए मिनट में पीबीएस चैनल के साथ बाहर फ्लश.
- 5 / मिलीलीटर मिनट पर एक ही समय में 20 मिनट के लिए 20% AF488 सीडी 4 + एंटीबॉडी, 0.2% DAPI शेयर समाधान, और 10% माध्यमिक CD3 + एंटीबॉडी सुई .
- 20 मिनट के लिए सेते हैं.
- 5 मिलीग्राम / 15 मिनट के लिए मिनट में पीबीएस चैनल के साथ बाहर फ्लश.
- फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की गणना:
- (ऑप्टिकल) सफेद - काले और सफेद: सेल और धूल
- (DAPI) यूवी - केवल ब्लू: सेल
- ब्लू (सीडी 4 +) - ग्रीन: टी लिम्फोसाइट और monocyte
- ग्रीन (CD3 +) - केवल लाल: टी lymphocyte
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS microchannel | Fabricated by SU-8 mold | |||
Blood | Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital. | |||
PBS | Buffer | Invitrogen | 14190 | 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline. |
FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | Diluted to 10% from stock solution with PBS. | |
Anti-CD4+ biotinlayted Ab | Beckman Coulter Inc. | IM0704 | Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water. | |
goat anti-hCD3delta | pAB | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1128 | Diluted to 10% from stock solution with PBS |
rabbit anti-goat IgG PE | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-3755 | Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS | |
anti-human CD4+ | BD Biosciences | 557695 | Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS. | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS. |