Summary
Protocol
- Prepare canais microfluídicos com anti-CD4 + biotinlayted superfície.
- Injectar 10 ml de amostra de sangue de 5 ml / min no canal microfluídicos com bomba de seringa.
- Lavar o sangue de 20 ml / min para 20 min com PBS.
- Injectar a solução diluída de lise FACS (diluído a 10% da solução estoque com PBS) em 5ul/min por 15 min.
- Incubar por 15 min.
- Injetar CD3 + solução de anticorpos primários (diluído a 10% da solução estoque com PBS) a 5 ml / min para 20 min.
- Incubar por 2 horas.
- Lave canal com PBS, 5 ml / min para 15 min.
- Injectar 20% AF488 CD4 + de anticorpos, solução estoque 0,2% DAPI, e 10% CD3 + anticorpo secundário a 5 ml / min para 20 min, ao mesmo tempo.
- Incubar por 20 min.
- Lave o canal com PBS, 5 ml / min para 15 min.
- Contagem de células ao microscópio fluorescente:
- White (óptica) - Preto e branco: célula e poeira
- UV (DAPI) - Blue: única célula
- Azul (CD4 +) - Verde: linfócitos T e monócitos
- Verde (CD3 +) - Vermelho: linfócitos T só
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS microchannel | Fabricated by SU-8 mold | |||
Blood | Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital. | |||
PBS | Buffer | Invitrogen | 14190 | 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline. |
FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | Diluted to 10% from stock solution with PBS. | |
Anti-CD4+ biotinlayted Ab | Beckman Coulter Inc. | IM0704 | Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water. | |
goat anti-hCD3delta | pAB | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1128 | Diluted to 10% from stock solution with PBS |
rabbit anti-goat IgG PE | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-3755 | Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS | |
anti-human CD4+ | BD Biosciences | 557695 | Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS. | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS. |