Summary
Met het oog op nieuwe therapeutische paradigma's voor de behandeling van gliomen te evalueren, fysiologisch relevante modellen zijn essentieel. We maken gebruik van een implanteerbare gids schroef procedure voor de oprichting van intracraniale xenotransplantaatmodellen dat is sneller en veiliger dan stereotactische benaderingen.
Abstract
Het enten van menselijke tumorcellen in de hersenen van muizen immunosuppressie is een gevestigde methode voor de studie van de hersenen kanker inclusief glioblastoma (glioom) en medulloblastoom. De meest gebruikte stereotactische aanpak alleen toestaat voor de injectie van een enkel dier in een tijd, is arbeidsintensief en vereist zeer gespecialiseerde apparatuur. De gids schroef methode, oorspronkelijk ontwikkeld door Lal et al.., 1 werd ontwikkeld om omslachtige stereotactische procedures te elimineren. We hebben nu beschrijven een aangepaste gids schroef aanpak die is snel en uitzonderlijk veilig, die beide een kritische, ethische overwegingen. Met name onze werkwijze omvat nu een infusiepomp waarmee maximaal 10 dieren tegelijk worden geïnjecteerd met tumorcellen.
Om aan te tonen het nut van deze procedure, wij menselijke U87MG glioomcellen opgericht als intracraniële xenotransplantaten in muizen, die vervolgens werden behandeld met AMG102, een volledig humaan antilichaam gericht op HGF / verstrooien factor ondergaat momenteel klinische evaluatie 2-5. Systemische injectie van AMG102 verlengde significant de overleving van alle muizen met intracraniële U87MG xenografts en resulteerde in een aantal volledige genezing.
Deze studie toont aan dat de gids schroef-methode is een goedkope, zeer reproduceerbaar aanpak voor het vaststellen van intracraniële xenotransplantaten. Bovendien biedt een relevante fysiologische model voor de validatie van nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling van hersentumoren.
Protocol
1. Cellijnen
- U87MG glioma cellen worden gekweekt in grote weefselkweek kolven met DMEM-F12 aangevuld met 5% foetaal bovine serum (FBS).
- Cellen worden geoogst door het wassen kolven tweemaal met warm fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en incuberen ze op 37 ° C gedurende 5 minuten met 10 ml PBS, met 0,25% trypsine en 0,05% EDTA. Zodra cellen zijn opgeheven, zijn ze geplaatst in een 50 ml buis met 10 ml van de cultuur media en gecentrifugeerd (300 X g voor 4 min).
- Na het wassen, worden de cellen geresuspendeerd bij een concentratie van 10 x 10 6 / ml in cultuur media, waardoor voor een inenting van 50.000 cellen / ul 5.
- Cellen worden bewaard op ijs tot intracraniële injectie.
2. Gids schroef intracraniële bouten
Deze procedure kan worden uitgevoerd enkele dagen voorafgaand aan de injectie van de cellen. Alle hier beschreven procedures zijn uitgevoerd onder strikte steriele omstandigheden.
- Muizen (BALB / c nu / nu vrouw, 5-6 weken, ongeveer 18 g) zijn genummerd voor identificatiedoeleinden, gewogen en onder narcose met een intraperitoneale (IP) injectie van een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg).
- De huid wordt afgeveegd neer met een jodium-oplossing en een kleine incisie (2-3 mm) is gemaakt langs de rechterkant van de middellijn en anterior naar de interaurale lijn. Dit onthult de coronale en sagittale hechtingen van de schedel. De bregma is geplaatst op de kruising van deze twee hechtingen.
- De gids schroef entry point is dan gemarkeerd op een punt 2,5 mm lateraal en 1 mm juist voor de bregma. Dit punt bevindt zich direct boven de nucleus caudatus 1.
- A 1 x 1 mm diep gat is geboord met een steriele hand gehouden spiraalboor door de schedel naar de dura.
- Een gesteriliseerde gids schroef die 1,6 mm verlengt onder het oppervlak van schedels in de dura wordt dan vastgeschroefd in het gat met een schroevendraaier tot gelijk met de schedel (figuur 1a).
- Een steriele stilet of schroef dummy wordt dan geplaatst in het centrale gat van de gids schroef aan de opening (Figuur 1B) te sluiten.
- De wond wordt gesloten met Vetbond Tissue Adhesive (n-butyl cyanoacrylaat) en de muizen krijgen een intraperitoneale injectie van reversine (kleine dieren) (0,1 ml / kg) en carprofen (5 mg/kg/100 ul) voor pijnstilling. Muizen worden dan toegestaan om terug op een warming mat (36 ° C), die kan oplopen tot 20 minuten. Muizen worden vaak gecontroleerd en waargenomen tijdens deze herstelperiode tot ze volledig bij bewustzijn.
3. Intracraniële cellulaire aanslaan
- Een steriele geboeid Hamilton spuit wordt bereid door het aanbrengen van een klein plastic ring om de naald zodat alleen 2 mm van de naald uit te breiden onder de gids schroef uitlaat (Figuur 1B). De laatste inoculatie punt is dan ook 3,5 mm onder de schedel oppervlak.
- Vier dagen na de gids schroef operatie, de muizen weer verdoofd als hierboven (2.1) en een kleine incisie wordt gemaakt over de gids schroef om de stilet verwijderen.
- De geboeid Hamilton spuit is vervolgens gevuld met 5 pi van goed gemengd cellen die voorzorg niet te maken of op te stellen eventuele luchtbellen.
- De spuit is bevestigd aan de perfusie pomp en de naald wordt ingebracht in de gids schroef (figuur 1C). De cellen worden vervolgens toegediend met een snelheid van 30 ul per uur.
- De geautomatiseerde apparatuur (figuur 1D) liet ons toe om maximaal te injecteren tot 10 dieren in een tijd op een constant debiet. Cellen kunnen ook handmatig worden geïnjecteerd met behulp van de handboeien hamilton spuit of als alternatief de spuit kan worden geboeid door een 200 ul pipettip die is gegarneerd met 3 mm, zodat de naald tot voorbij de gids schroef uit te breiden met 2 mm. De injectie moet dan worden uitgevoerd bij een constante gestaag tempo.
- Wanneer infusie is voltooid, is de spuit zorgvuldig verwijderd en de stilet wordt vervangen in de gids schroef. De wond is gelijmd gesloten en de muizen worden gegeven herstel van medicijnen als voorheen (2.7) en om te herstellen op een warming mat.
4. Therapeutische uitdaging
- Vier dagen na de inoculatie U87MG cel, zijn muizen gewogen en willekeurig verdeeld in controle en behandeling van groepen.
- De controle groep krijgt een intra-peritoneale (IP) injectie van PBS (100 pl), terwijl de behandelde groep krijgt een IP-injectie van AMG102 (100 ug in 100 ul PBS).
- Injecties worden herhaald om de tweede dag gedurende 14 dagen, in totaal 6 injecties (figuur 2).
- Na de laatste injectie, zijn muizen dagelijks gecontroleerd en gewogen om de dag.
- Als muizen begon te significante neurologische disfuncties (evenwicht stoornis, verlamming), uitdroging, of meer dan 10% gewichtsverlies of stervende weer te geven, werden ze humaan afgemaakt. Deze humane eindpunt dag werden vervolgens opgenomen op de Kaplan-Meier survival curve.
5. Evaluatie van de therapeutische efficiëntie
6. Representatieve resultaten:
Controle dieren begon te tekenen van neurologische verstoring en gewichtsverlies 23 dagen zien na de eerste inoculatie van cellen. Dit was significant vertraagd in de AMG102 behandelde groep tot 35 dagen. Inderdaad door de dagen 35, 77% (n = 7 / 9) van de controle groep was ingeslapen. De Kaplan-Meier survival curve toont duidelijk de sterke toename in overleving in reactie op AMG102 behandeling (figuur 3). Per dag 70, had 88% van de controle muizen zijn gedood (n = 8 / 9) in vergelijking met 37% (n = 3 / 8) van AMG102 behandelde groep. Histologische analyse van de hersenen bevestigd dat alle 9 dieren in de controlegroep ontwikkelden tumoren in vergelijking met slechts 3 van de 8 AMG102 behandelde muizen (figuur 4).
Figuur 1: Image (A) laat zien intracraniële gids schroef geplaatst in een gebied gelegen direct boven de nucleus caudatus. De geboeid hamilton spuit (vooraf geladen met cellen) wordt dan geplaatst in de gids schroef zodat 2 mm van de naald gaat verder dan de gids en de cellen worden ingespoten 3,5 mm binnen de nucleus caudatus. De spuit is later verwijderd en vervangen door een stilet (B). De automatische infusie apparaat (C) kan injecteren tot 10 dieren tegelijk. Hier worden vijf gelijktijdige injecties (D).
Figuur 2: Schematische weergave van studie protocol. Cellen werden geïnjecteerd op dag 0 met de behandeling begint op dag 4. Controle dieren kregen een injectie van PBS (100 ul) IP, terwijl de behandelde groep kreeg een injectie van AMG102 (100 μg/100 pi) IP. Deze injecties werden gegeven om de tweede dag gedurende 10 dagen. Een totaal van zes injecties werden gegeven. Dieren werden vervolgens gecontroleerd op 70 dagen op tekenen van neurologische en lichamelijke stoornissen.
Figuur 3: Kaplan-Meier survival curve te vergelijken controle en AMG102 behandelde muizen. Significant overlevingsvoordeel werd verkregen na de behandeling met AMG102 (p = 0,005).
Figuur 4: microfoto's van coronale hersenen secties tonen de ontwikkeling van tumoren in de controle dieren (A) en geen hersentumor ontwikkeling in de AMG102 behandelde dieren (B). Schaal bar is 1 mm.
Disclosures
Dit werk werd ondersteund door een onderzoeksbeurs van Amgen Inc
Acknowledgments
De auteurs willen graag Verlene Henry en Lindsay Holmes bedanken voor de hulp bij de ontwikkeling van dit model. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de James S. McDonnell Foundation (# 220020173).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| FCS | Bovogen | SFBS | |
| Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Balb/c nu/nu mice | ARC Perth | ||
| Screw Holder | Plastics One | SD-1 | |
| Drill Holder | Plastics One | DH-1 | |
| Drill Bit | Plastics One | D#60 | |
| Screw guide (metal) | Plastics One | C212SG | |
| Screw Dummy (stylus) | Plastics One | C212SD | |
| Hamilton Syringe (10 μl 26g cemented needle) | Grace Division Discovery Science | 80075 | |
| PHD 22/2000 infusion pump | Harvard Apparatus | 70-2003 | Optional |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Thermo pad | Harvard Apparatus | 340390 |
References
- Lal, S. An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals. J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).
- Jun, H. T. AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts. Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).
- Pillay, V. The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases. Neoplasia. 11, 448-458 (2009).
- Buchanan, I. M. Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102. J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).
- Wen, P. Y. A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma. Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).
- Caretti, V. Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model. Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).
- Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization. Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).
- Johns, T. G. The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization. Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).
- Scott, A. M. A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).
- Niyazi, M. Therapeutic options for recurrent malignant glioma. Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).
