Summary
Cellules M spécialisées dans un follicule associée épithélium couvrant les plaques de Peyer jouer un rôle important pour l'immunosurveillance des muqueuses dans l'intestin du tissu lymphoïde associé. Ici, nous avons décrit la méthode d'évaluation de transcytose bactérienne par les cellules M
Abstract
L'intérieur de notre intestin est habité avec un nombre énorme de bactéries commensales. La surface de la muqueuse du tractus gastro-intestinal est continuellement exposé à eux et occasionnellement à des agents pathogènes. Le tissu lymphoïde associé intestin (GALT) jouent un rôle clé pour l'induction de la réponse immunitaire muqueuse de ces microbes 1, 2. Pour initier la réponse immunitaire muqueuse, les antigènes des muqueuses doivent être transportés de la lumière intestinale à travers la barrière épithéliale dans les follicules lymphoïdes organisés tels que les plaques de Peyer. Cette transcytose antigène est médiée par des cellules spécialisées épithéliales M 3, 4. Cellules M sont atypiques des cellules épithéliales qui ont activement phagocyter macromolécules et les microbes. Contrairement aux cellules dendritiques (CD) et les macrophages, les antigènes cibles pour la dégradation des lysosomes, les cellules M transcytose essentiellement des antigènes internalisés. Cette transcytose macromoléculaires vigoureuse à travers les cellules M délivre antigène aux sous-jacente a organisé une follicules lymphoïdesD est considérée comme essentielle pour initier antigène spécifique la réponse immunitaire muqueuse. Cependant, les mécanismes moléculaires favorisant cette absorption d'antigène par les cellules M sont largement inconnus. Nous avons précédemment rapporté que la glycoprotéine 2 (GP2), spécifiquement exprimé sur la membrane plasmique apicale des cellules M des entérocytes, sert de récepteur transcytotiques pour un sous-ensemble de commensaux et entérobactéries pathogènes, dont Escherichia coli et Salmonella enterica sérotype Typhimurium (S. Typhimurium ), en reconnaissant FimH, un composant de type I pili sur la membrane bactérienne externe 5. Ici, nous présentons une méthode pour l'application de doser un Peyer souris correctif anse intestinale afin d'évaluer l'absorption par les cellules bactériennes M. Cette méthode est une version améliorée du test en boucle intestinale de souris précédemment décrites 6, 7. Les points sont améliorés comme suit: 1. L'isoflurane a été utilisé comme un agent anesthésique. 2. Environ 1 cm ligaturé y anse intestinalePatch ING Peyer a été mis en place. 3. Les bactéries absorbées par les cellules M ont été marquées par fluorescence par le réactif de marquage par fluorescence ou par surexpression de la protéine fluorescente comme la protéine fluorescente verte (GFP). 4. Cellules M dans l'épithélium du follicule associée couvrant les plaques de Peyer ont été détectées par l'ensemble de montage immunostainig avec Gp2 anticorps anti. 5. Fluorescent transcytose bactérienne par les cellules M ont été observées par l'analyse microscopique confocale. Le dosage de Peyer souris correctif anse intestinale pourrait fournir la réponse quel genre de bactéries pathogènes ou commensales transcytosed par les cellules M, et peut nous amener à comprendre le mécanisme moléculaire de la façon de stimuler le système immunitaire muqueux à travers les cellules M.
Protocol
1. Préparation des cellules bactériennes
- Glycérol Streak stockés bactéries fluorescentes (GFP, comme exprimant S. Typhimurium) sur une plaque de gélose LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline.
- Culture d'une seule colonie d'agar LB nuit dans 2 ml de milieu LB nouvelles.
- Ajouter 0,5 ml de culture bactérienne à 4,5 ml de milieu LB et incuber de nouvelles jusqu'à ce densité optique de 1,0 à 600 nm est atteint.
- Récolte des cellules bactériennes par centrifugation (3000 xg, 5 min, 4 ° C).
- Jeter le surnageant et laver deux fois avec 5,0 ml de solution stérile tampon phosphate salin (PBS).
- Resuspendre culot bactérien avec 5 ml de PBS, et utiliser 50 pl de la suspension contenant environ 10 7 unités formant colonie (UFC) que l'inoculum.
- En cas d'utilisation de bactéries marquées par fluorescence, les cellules bactériennes ont été marqués par réactif de marquage par fluorescence selon le protocole standard.
2. Unenesthesia
- Remplissez un petite boîte en plastique (10 x 10 x 5 cm) avec 5% (v / v) vaporisé isoflurane mélangé à l'air (débit: 200 ml / min).
- Anesthetize de huit à seize faibles, âgé de souris mâles ou femelles dans la boîte.
- Déplacez la souris à une table d'autopsie après l'anesthésie.
- Continuellement anesthésier la souris de 2% (v / v) vaporisé isoflurane mélangé à l'air (débit: 200 ml / min) (figure 1). Ceci est une procédure terminale.
3. Ligaturé Peyer de dosage de patch en boucle
- Inciser 1cm de la peau abdominale, puis couper le péritoine abdominal d'une souris anesthésiée et de prendre le petit intestin contenant plaques de Peyer.
- Ligaturer l'intestin avec un fil à coudre, en prenant soin d'éviter les vaisseaux sanguins. Remarque: ne lient d'un côté de l'intestin, et laissez l'autre côté lâche.
- Injecter 50 ul de suspension bactérienne ou PBS (contrôle) avec une seringue dans la boucle de patch ligaturé Peyer sur la s lâcheside de l'intestin (figure 2).
- Bind côté lâche, et fermer l'abdomen de la souris avec un clip.
- Après 1 h, retirez la boucle de patch ligaturé Peyer, et euthanasier la souris par dislocation cervicale.
- Peyer accise du correctif de la boucle de plaques de Peyer ligaturé.
- Flasher le côté apical des plaques de Peyer par 1ml de PBS avec l'aide de la seringue attachée à une aiguille pour enlever l'excès de liquide muqueux et les bactéries. Clignotant plaques de Peyer deux autres fois.
4. Coloration monter ensemble et une analyse microscopique confocale d'plaques de Peyer
- Fixer les plaques de Peyer de BD Cytofix / Cytoperm solution sur la glace pendant 1 heure.
- Laver les plaques de Peyer trois fois avec 1ml de BD Perm / Wash buffer pendant 5 min, puis bloquer avec 1 ml de tampon de blocage contenant 0,1% (p / v) de saponine, de 0,2% (p / v) de BSA dans du PBS pendant 30 min sur glace.
- Ajouter 200 fois diluée anti-souris GP2 anticorps monoclonal (5 pg / ml) à l'échantillon pour détecterCellules M.
- Incuber pendant 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Laver trois fois avec 1 ml de PBS froid, puis ajouter 200 fois diluée anti-rat IgG conjugué avec DyLight549 (20 pg / ml) à l'échantillon.
- Incuber l'échantillon sur la glace pendant 2 heures.
- Laver trois fois avec 1 ml de PBS froid, puis ajouter 50 fois diluée Alexa 633 phalloïdine conjugué à l'échantillon pour détecter la F-actine.
- Incuber sur la glace pendant 2 heures.
- Laver doucement avec 1 ml de PBS froid. Ensuite lieu trois à quatre morceaux de verre couvercle circulaire sur une lame, et d'intégrer les spécimens dans une solution de 30% de glycérol dans du PBS sur la lame (figure 3).
- Observez les échantillons avec un microscope DM-IRE2 confocale à balayage laser ou un microscope déconvolution DeltaVision Restauration.
5. Les résultats représentatifs:
L'exemple spécimen d'une souris ligaturé test de Peyer correctif boucle avec GFP-S. Typhityphimurium a été observée avec un microscope DeltaVision déconvolution Restauration (figure 4). GFP-S. Typhimurium est transcytosed par GP2 cellules M +. Un dosage de Peyer souris correctif anse intestinale peut identifier le type de bactéries commensales ou pathogènes qui peuvent être transcytosed par les cellules M.
Figure 1. Anesthésie de souris sous condition isoflurane vaporisé. Vaporisé isoflurane a été fourni par un appareil d'anesthésie-dédié (côté gauche).
Figure 2. Résumé du dosage de Peyer ligaturé correctif anse intestinale. La suspension bactérienne fluorescente a été injectée par seringue dans la boucle de patch ligaturé Peyer sur le côté lâche de l'intestin.
Figure 4. Exemple d'une souris ligaturé test de Peyer correctif boucle avec GFP-S. Typhimurium. GP2, qui est signalé comme marqueur de cellule spécifique M 5, a été coloré avec des anticorps anti-souris GP2 (rouge). Le spécimen a été observé avec un microscope DeltaVision déconvolution Restauration. Exprimant la GFP S. Typhimurium a été co-localisé avec GP2 sur la membrane plasmique apicale des cellules M et dans les vésicules cytoplasmiques subapicale (flèches). Haut, vue apicale. Fond et les côtés, des vues latérales. Barre d'échelle: 10 um.
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Discussion
Le temps d'incubation du patch ligaturé Peyer avec suspension bactérienne est habituellement pendant 1 heure pour observer l'incorporation dans les cellules bactériennes M. Dans le cas de 4 h d'incubation, les bactéries sont souvent détectées dans la zone de cellules T des plaques de Peyer. Comme l'anesthésie par inhalation d'isoflurane vaporisée pourrait garder les souris stable, le temps d'incubation de plaques de Peyer ligaturé avec suspension bactérienne est extensible à observer les bactéries qui s'installent dans des cellules T dans la zone de plaques de Peyer. Le point important de cette expérience est de prendre soin de ne pas rayer le vaisseau sanguin lorsque la ligature de l'intestin. Dans le cas de ne pas utiliser la GFP exprimée bactéries, on peut également utiliser des bactéries marquées par fluorescence par le réactif de marquage par fluorescence commerciales. Si le réactif inhibe éventuellement bactérien, ce qui vous voulez utiliser, l'attachement à la molécule exprimée sur les cellules M, vous devez utiliser l'anticorps primaire spécifique, le cas échéant, de détecter les bactéries incorporées.
ONTENU "> La méthode de la boucle ligaturée test a été décrit précédemment 6, 7, nous améliorer certains points de cette méthode comme suit:.. 1 L'isoflurane est utilisé comme agent anesthésique pour garder les souris régulière 2 à environ 1 cm ligaturé anse intestinale, y compris de Peyer.. patch est mis en place. 3. Bactéries absorbé par les cellules M sont marqués par fluorescence par le réactif de marquage par fluorescence ou par surexpression de la protéine fluorescente comme la GFP. 4. cellules M dans l'épithélium du follicule associée couvrant les plaques de Peyer sont détectés par l'ensemble de montage immunostainig avec anticorps anti GP2. 5. Fluorescent transcytose par des cellules bactériennes M sont observées par analyse microscopique confocale.Nous et d'autres ont démontré que les diverses antigènes hétérogènes activement gagner l'entrée dans les cellules M. Un nombre important d'agents pathogènes dont Salmonella spp. Shigella spp., Yersinia spp. exploiter les cellules M pour les 8-10 invasion de l'hôte. Par ailleurs, la forme coccus des Helicobacter pylori peut potentiellement translocation dans les plaques de Peyer par les cellules M, et cette translocation est essentiel pour l'induction d'une inflammation chronique de l'estomac 11. D'autre part, les mécanismes par lesquels ces agents pathogènes envahissent les cellules M restent à élucider. Nous suggérons que le dosage de Peyer ligaturé du correctif boucle est une méthode expérimentale appropriée pour disséquer les interactions entre les cellules M et les agents pathogènes in vivo.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier tous les membres de la BEI pour développer cette technique. Cette recherche a été financée en partie par Grant-in-Aid pour la recherche scientifique sur les domaines prioritaires "Trafic membranaire» (HO), et «Matrice des phénomènes infectieux" (KH), les jeunes scientifiques (SF et KH), et de la Recherche Scientifique (HO ), et de la recherche scientifique sur les domaines innovants "Logistique intracellulaire" (HO), du ministère de l'Éducation, Culture, Sports, Science et Technologie du Japon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Agar Ampicillin- 100 | SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack | GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus | Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution | BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody | MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope | Applied Precision | DeltaVision Core |
References
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