Trasfezione genica mediante elettroporazione è migliorato di circa due volte quando l'orientamento del campo elettrico viene modificato durante l'applicazione di impulsi, mentre la vitalità cellulare non è interessato. L'aumento della transfezione genetica è causata dalla crescita dell'area membrana che è competente per l'ingresso del DNA nella cellula.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Cambiare la direzione e l'orientamento del campo elettrico durante l'applicazione impulsi elettrici migliora il trasferimento plasmidi Gene In vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gene electrotransfer è un metodo fisico usati per fornire i geni nelle cellule mediante l'applicazione di impulsi elettrici brevi e intensi, che causano destabilizzazione della membrana cellulare, rendendo permeabili a molecole piccole e permette il trasferimento di grandi molecole come il DNA. Rappresenta un'alternativa ai vettori virali, grazie alla sua sicurezza, efficacia e facilità di applicazione. Per gene electrotransfer diversi protocolli di impulsi elettrici vengono utilizzati al fine di ottenere il massimo transfezione genica, uno di loro sta cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento durante la consegna degli impulsi. Cambio di direzione del campo elettrico e l'orientamento aumentare la superficie della membrana competente per l'ingresso del DNA nella cellula. In questo video, dimostriamo la differenza di efficacia gene electrotransfer quando tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione e quando gli impulsi vengono consegnati alternativamente cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento. A questo scopo punta con elettrodi integrati e ad alta tensione prototipo di generatore, che permette di cambiare di campo elettrico in diverse direzioni durante l'applicazione di impulsi elettrici, sono stati utilizzati. Gene efficacia electrotransfer è determinato 24 ore dopo l'applicazione di impulsi come il numero di cellule che esprimono la proteina fluorescente verde divisa con il numero di tutte le cellule. I risultati mostrano che la transfezione genica è aumentata quando l'orientamento del campo elettrico durante la consegna degli impulsi elettrici è cambiato.
Protocollo
1. Coltura cellulare, il plasmide e la preparazione del buffer per l'esperimento
- In questo esperimento le cellule ovariche di criceto cinese (CHO-K1) sono utilizzati. Le cellule sono coltivate in una miscela di nutrienti HAM-F12 (PAA) integrato con 2 mM di L-glutamina, 10% di siero fetale bovino, 400 microlitri / l gentamicina (tutti da Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Germania), e 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagabria, Croazia). Le cellule sono conservate a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 nell'atmosfera nell'incubatrice per 24 ore.
- Amplificare plasmide pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA) che codifi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Gene electrotransfer è una tecnica biotecnologica versatile che consente il trasferimento del DNA nelle cellule mediante l'applicazione di brevi impulsi elettrici ad alta tensione 3 e rappresenta una alternativa più sicura di vettori virali per la sua sicurezza, efficacia e facilità di applicazione. Anche se gene electrotransfer oggi è ampiamente utilizzata per trasfettare tutti i tipi di cellule e prima fase io studio clinico con questo metodo è stato segnalato 4, i meccanismi alla base non so.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agenzia di ricerca sloveno (progetto J2-9770, IP-0510 centro infrastrutturali e programma P2-0249). Questo video rappresenta materiale supplementare per il "Elettroporazione basato Tecnologie e Trattamenti" laboratorio scientifico e corso post-laurea, organizzato dalla Facoltà di Ingegneria Elettrica presso l'Università di Lubiana, Slovenia. Autori ringraziano anche Dusa Hodzic per la gentile fornitura del DNA plasmidico.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| HAM-F12 | PAA | E15-016 | terreno di coltura |
| L-glutammina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| siero fetale bovino | PAA | A15-151 | |
| gentamicina | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotico |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotico |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratori | 6085-1 | DNA plasmidico |
| HiSpeed Kit Maxi plasmidi | Qiagen | 12662 | |
| Na 2 HPO 4 | Merck | F640786 933 | |
| NaH 2 PO 4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl 2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| saccarosio | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| tripsina / EDTA soluzione | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| puntale | Una soluzione su misura | ||
| generatore di impulsi elettrici | Una soluzione su misura | ||
| 6 pozzetti | TPP | 92406 | |
| Centrifuga da 15 ml tubo | TPP | 91015 | |
| 75 centimetri 2 cultura fiasco | TPP | 90076 |
Riferimenti
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for sma....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
