리프트 밸리 열병 바이러스 MP - 12 백신 스트레인에 대한 역방향 유전 시스템은 증가 감쇄 및 immunogenicity로 추가 MP - 12 돌연변를 만들기위한 유용한 도구입니다. 우리는 NSS 돌연변이 변종을 생성하고 특성화 프로토콜을 설명합니다.
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방법 논문
리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여
이 논문에서
요약
초록
출혈성 발열, 신경 장애 또는 인간의 실명 및 고속 낙태와 ruminants 1 태아의보기 흉한 것의 원인이 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV)는, 선택한 에이전트 및 위험 그룹 3 병원체를 중복 HHS / USDA으로 분류되었습니다. 그것은 가족 Bunyaviridae에 속 Phlebovirus에 속한이 가족의 가장 악성 멤버 중 하나입니다. RVFV MP - 12 백신 스트레인 2,3뿐만 아니라 ZH548 및 ZH501를 포함한 야생 형 RVFV의 변종 4-6에 대한 몇 가지 역방향 유전 시스템은 2006 년부터 개발되었습니다. MP - 12 변형은 (위험 그룹 2 병원체가 아닌 선택 대리인되는) 몇몇은의 돌연변이 M과 L - 세그먼트로 높은 감쇠 있지만, 여전히 기능 독기를 인코딩 악성 S - 세그먼트 RNA 3, 운반 요소, NSS. 그것으로 effic 복제하면서 rMP12 - C13type (C13type)는 NSS ORF의 삭제 - 프레임의 69 % 나르는 것은, 모든 알려진 NSS 기능을 결여ient는 VeroE6 세포의 MP - 12 타입 - I IFN에 부족 않습니다. NSS는 인터페론 (IFN) - 베타 mRNA 7,8를 포함하여 호스트 전사의 종료 - 오프를 유도하고 사후 translational 수준에서 두 번 좌초 RNA - 의존 단백질 키나제 (PKR)의 저하를 추진하고 있습니다. 9,10 IFN - 베타 transcriptionally입니다 인터페론 규제 요인 3 (IRF - 3), NF - KB 및 활성 단백질 1 (AP - 1) 및 IFN-alpha/beta 수용체에 IFN - 베타의 바인딩 (IFNAR)에 의해 upregulated는 IFN - 알파의 전사를 촉진 NSS에 의한 IFN - 베타 유전자를 포함하여 호스트 전사 억제 바이러스는 복제에 대한 응답으로 그 ISGs의 유전자 upregulations을 방지 반면, 호스트 항바이러스 활동을 유도 유전자 또는 다른 인터페론 자극 유전자 (ISGs) 11, 비록 IRF - 3, NF - KB와 활성제 단백질 1 (AP - 1) RVFV7에 의해 활성화될 수 있습니다. . 따라서, NSS 추가 MP - 12을 자제하고, IFN - 베타 억제 기능을 폐지하여 호스트 타고난 면역 반응을 향상시킬 수있는 좋은 대상입니다. 여기에우리는 재조합 MP - 12 인코딩 변이된 NSS 창출을위한 프로토콜을 설명하고, IFN - 베타 mRNA 합성을 억제하는 기능을 부족한 NSS 돌연변이를 확인하기 위해 검사 방법의 예를 제공합니다. 타고난 면역에 그 본질적인 역할뿐만 아니라, 입력 - I IFN이 돌기 세포 및 적응 면역 반응의 유도 12-14의 성숙을 위해 중요합니다. 따라서, NSS의 돌연변이 타입 - I IFN을 유도하는 것이 더 감쇠 있지만, 동시에 접종 방식에 적합하게 후보자 야생 형 MP - 12보다 자극 호스트 면역 반응에 더 효율적입니다.
프로토콜
1. 플라스미드 DNAs 2 재조합 MP - 12 인코딩 NSS 변이 (들)의 복구
- 보급 아기 햄스터 신장 (BHK) / T7 - 9 세포 15, 안정적으로 표현 T7 RNA 효소, 최소 필수 매체 6 cm 요리로 (가상) 알파 10% 태아 소 혈청 (FBS를 포함하는 (Invitrogen, 고양이 # 32561037) ), 페니실린 - 스트렙토 마이신 (페니실린 : 100 U / ML, 스트렙토 마이신 : 100 μg / ML) (Invitrogen, 고양이 # 15140122), 600 μg / hygromycin B의 ML (Cellgro, 고양이 # 30-240 - CR).
* 바이러스 복구의 효율은 35 mm 요리보다 6 cm의 요리 높다. 낮은 통로 수준 BHK/T7-9 세포는 회복의 높은 속도를 지원합니다. 또는 다른 BHK 세포 라인 안정 표현 T7 RNA 효소는 4,5,16,17를 사용할 수있다. - 세포 confluency 70~80%에 도달하면 신선한 10% FBS 및 스트렙토 마이신 페니실린 -을 (hygromycin B를 포함하지 않는)가 포함된 가상 - 알파. 문화 뜨는 교체
* 세포 transfecte해야D T7 RNA 중합 효....
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토론
RVFV에 대한 유전학 시스템을 리버스는 T7 프로 모터 2,4,5 드나 마우스 3 인간 4 POL - I 프로 모터를 이용하여 여러 그룹에 의해 개발되었습니다. 이 원고에서는, 우리는 BHK/T7-9 세포 15되는 안정 표현 T7 RNA 효소를 사용하여 재조합 RVFV MP - 12 계통을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 바이러스 복구의 효율 BHK/T7-9 세포의 상태에 따라 다양, plasmids의 양을, transfected 세포 등등의 번호입니다. 우리는 항상 실험에 대한 높은 titer의 바이러스 주식을 취득 Vero E6 세포에서 P0 바이러스를 증폭. 이러한 인간의 폐 diploid (MRC - 5) 세포와 같은 타입 - I IFN - 관할 세포는 NSS 입력 - I IFN이나 PKR 포함한 억제 항바이러스 활동으로 효율적인 바이러스 복제를 지원하는 기능을 경우에만 바이러스 증폭에 사용될 수 있습니다.
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공개 사항
우리는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 작품은 부여 5 번 우수 서양 지역 센터 (WRCE)를 통해 U54 AI057156 - 07, 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 1 R01 AI08764301 - A1, 그리고 대학에서 백신 개발을위한 Sealy 센터에서 내부 자금으로 투자되었다 텍사스 의료 지점.
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재료
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| 최소 필수 중간 (가상) - 알파 | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco의 수정 최소 필수 배지 | Invitrogen | 11965092 | |
| 수정 독수리 중간 (가상 2X) | Invitrogen | 11935046 | |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240 - CR | |
| Tryptose 인산 국물 | MP의 biomedicals | 1,682,149 | |
| 귀족 한천 | VWR | 101170-362 | |
| 대중 교통 - LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti - 가상 | Invitrogen | 31985070 | |
| 에어로졸 꽉 뚜껑 | Eppendorf | C - 2223-25 | |
| 0.33 % 중성 빨간색 솔루션 | 시그마 알드리치 | N2889 - 100ML | |
| C57/WT MEF 세포 | InvivoGen | mef - c57wt | |
| Blasticidin S | InvivoGen | 개미 - BL - 1 | |
| Zeocin | InvivoGen | 개미 - zn - 1 | |
| QUANTI - 블루 | InvivoGen | 담당자 - qb1 | |
| BHK/T7-9 세포 15 | 기후 대학, 일본 | ||
| Vero E6 세포 | ATCC | CRL - 1586 |
참고문헌
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, an....
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