Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية

Published: February 15, 2012 doi: 10.3791/3820

Summary

المتفطرة السلية تشكل الأغشية الحيوية المخدرات متسامح عندما تربيتها في ظروف معينة. نحن هنا وصف أساليب لزراعة M. الأغشية الحيوية والسل، وتحديد وتيرة صوامد المخدرات متسامح. وهذه البروتوكولات أن تكون مفيدة لمزيد من الدراسات في آليات التسامح المخدرات في م. مرض السل.

Abstract

المتفطرة السلية، وكيل خاص بأسباب الأمراض من مرض السل البشري، لديه قدرة غير عادية على البقاء على قيد الحياة ضد الضغوط البيئية بما فيها المضادات الحيوية. على الرغم من تحمل الإجهاد من م. مرض السل هو واحد من المساهمين على الأرجح إلى العلاج الكيميائي لمدة 6 أشهر طويلة من مرض السل والآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا النمط الظاهري مميزة من مسببات المرض لا تزال غير واضحة. لقد تطورت الأنواع الجرثومية العديد من البقاء على قيد الحياة في البيئات المجهدة عن طريق تجميع الذاتي في السطح، ودرجة عالية من التنظيم المرفقة، وهياكل مصفوفة مغلفة تسمى الأغشية الحيوية 2-4. النمو في المجتمعات ويبدو أن استراتيجية البقاء على قيد الحياة المفضل للميكروبات، ويتحقق من خلال المكونات الجينية التي تنظم مرفق السطح، والاتصالات بين الخلايا، وتجميع المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) 5،6. ومما يسهل على الأرجح إلى التسامح الإجهاد البيئي من قبل العائد على السهم، وربما من قبل physiological التكيف من عصيات الفردية لmicroenvironments غير متجانسة ضمن بنية معقدة من الأغشية الحيوية 7.

في سلسلة من الأوراق الأخيرة التي أنشأنا م. والسل، واللخنية المتفطرة لديها ميل قوي للنمو في هياكل متعددة الخلايا المنظمة، ودعا الأغشية الحيوية، والتي يمكن أن تحمل أكثر من 50 أضعاف الحد الأدنى من تركيز المثبطة من الأدوية المضادة للسل الإيزونيازيد والريفامبيسين 8-10. م. مرض السل، ولكن يتطلب يثير الاهتمام والفضول شروط محددة لتشكيل الأغشية الحيوية الناضجة، في نسبة معينة من فراغ الرأس 9:01: وسائل الإعلام، فضلا عن تبادل محدود من الهواء مع الغلاف الجوي 9. ربما يمكن أن متطلبات الظروف البيئية المتخصصة أن ترتبط إلى حقيقة أن م. مرض السل هو الممرض تلزم الإنسان، وبالتالي تكيفت مع البيئات الأنسجة. في هذا المنشور نظهر طرق زراعة M. مرض السلالأغشية الحيوية في زجاجة، وشكل لوحة 12-جيد، وهو مناسب للدراسات البكتريولوجية وكذلك الوراثية. وقد وصفت نحن على بروتوكول لسلالة ضعيفة من م. والسل، ومولودية 2 7000، مع الحذف في مواضع اثنين، panCD وRD1، التي تعتبر بالغة الأهمية للنمو في الجسم الحي من 9 الممرض. ويمكن استخدامها بأمان هذه السلالة في احتواء BSL-2 لفهم البيولوجيا الأساسية للمرض السل الممرض وبالتالي تجنب شرط وجود مرفق BSL-3 باهظة الثمن. ويمكن تمديد هذا الأسلوب، بعد إجراء التعديلات المناسبة في وسائل الإعلام، أن ينمو بيوفيلم من الأنواع الأخرى بالمتفطرات زروع.

وعموما، فإن بروتوكول موحد للاستزراع الأغشية الحيوية بالمتفطرات مساعدة المحققين المهتمين بدراسة الخصائص الأساسية مرونة من متفطرات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن طريقة واضحة وموجزة من الأغشية الحيوية بالمتفطرات متزايد يساعد أيضا في الجرد السريرية والدوائيةestigators لاختبار مدى فعالية دواء المحتملة.

Protocol

1. تزايد الأغشية الحيوية من M. مرض السل في زجاجة المسمار 250ml الاتحاد توج

  1. وسائل الاعلام التحضير: ذوب 0.5g من KH 2 PO 0.5g من MgSO 4G من الهليونين-L، 2G من حامض الستريك، 0.05g من سيترات الأمونيوم الحديديك، 60mL من الجلسرين في 900mL من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم. الأوتوكلاف، باردة وفقط قبل بدء التجربة، إضافة ZnSO معقم 4 إلى تركيز النهائي من 0.1٪ ث / v منذ مولودية 2 7000 هو عوني التغذي بانتوثينات هذه السلالة يتطلب أيضا حامض البانتوثينيك في 10μg/mL من تركيز نهائي.

ملاحظة: هذا هو تكوين معيار وسائل الإعلام Sauton لاستخدامها لمرض السل م. ومع ذلك، يمكن إذا لزم الأمر أيضا وسائل الإعلام المتخصصة الأخرى يمكن استخدامها للأنواع الأخرى بالمتفطرات.

  1. اللقاح إعداد: م. تنمو مرض السل في 7H9OADC مع 0.05٪ توين-80 لمدة أسبوع، أو OD 600 بنسبة 0.7 إلى 1.0. وطبقا لتقديراتويمكن استخدامها مباشرة كما lture اللقاح حتى التخفيف 1:100.
  2. الاستغناء عن وسائل الإعلام 25mL Sauton لزجاجة المسمار البوليسترين توج 250ml الاتحاد (كورنينج). إضافة 250μl من اللقاح على المدى المتوسط، وكأب الزجاجة بإحكام جدا ووضعه دون عائق في حاضنة مرطب 37 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع. مراقبة زجاجة مرة واحدة كل يوم للتأكد من عدم وجود تلوث.
  3. في نهاية الأسبوع الثالث، وتخفيف الحد الأقصى من القمقم للسماح للمزيد من النمو من م. مرض السل في واجهة. إذا لم يتم تخفيف الغطاء في هذه المرحلة ثم فإن تركيز الاكسجين في حاوية تؤخر تحقيق المزيد من النمو من البكتيريا.

2. نمو م. الأغشية الحيوية السل في 12-جيدا لوحات

  1. تعد وسائل الإعلام واللقاح من مولودية 2 7000 كما هو موضح في المقاطع A1 و A2.
  2. مزيج من وسائل الإعلام مع 60mL 600μl من اللقاح. الاستغناء 4.5mL من الخليط في كل بئر من لوحة. تغطية لوحة مع غطاء. التفاف لوحة عدة مرات مع parafilm. احتضان لوحة دون عائق في حاضنة مرطب على 37 درجة مئوية لمدة 5 أسابيع.

3. تحديد وتيرة صوامد المخدرات متسامح في م. السل الأغشية الحيوية

  1. تنمو م. والأغشية الحيوية مرض السل في شكل 12-جيدا كما هو موضح في الفرع باء يستغرق ذلك ما مجموعه نحو أسبوعين-5.
  2. مرة واحدة ونضجت الأغشية الحيوية (بعد 5 أسابيع من حضانة) حقن اختيارك للمضادات الحيوية في تركيز المطلوب في وسائل الاعلام تحت الأغشية الحيوية باستخدام microtip في ماصة.

ملاحظة: إن حجم وسائل الاعلام تحت pellicles يقلل إلى حوالي 3.0mL. لذا يجب أن المحققين وفقا لذلك حساب كمية من المخدرات.

  1. دوامة لوحة بلطف بحيث تنتشر تماما المضادات الحيوية على المدى المتوسط. لتحقيق نتائج يعتد بها إحصائيا، حقن عنتيبيأذني في أربعة آبار. في موازاة ذلك، حقن نفس الحجم من المذيب الذي تم حله في المضادات الحيوية في الآبار الأربعة الأخرى، وترك الماضي أربع آبار من لوحة لم يمسها. تغطية لوحة مع غطاء ووضع طبقات جديدة من parafilm حول اللوحة. وضعها مرة أخرى في الحاضنة لمدة الوقت المطلوب.
  2. في نهاية الحضانة، وفتح لوحة وإضافة توين-80 للتركيز النهائي من 0.1٪ (حجم / حجم) في كل من الآبار. دوامة لوحة كاملة بلطف لتشتيت موحد للمنظفات. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. مزيج من كل محتوى جيد مع عدة مرات ماصة بحيث يمكن أن المحتوى كله بشكل موحد على نقل أنبوب مخروطي 15mL.
  3. تدور باستمرار على محتوى أنبوب في 4000rpm لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. Resuspend لبيليه في 5ml من عازلة غسيل الطازجة (PBS مع الجلسرين بنسبة 10٪ و 0.05٪ توين-80). تكرار الغسيل ثلاث مرات. Resuspend لبيليه في 5ml من غسل العازلة. يبقيه على الكرسي الهزاز لسvernight في 4 درجات مئوية.

ملاحظة: على الرغم من أن وضعت أصلا لدرجة حرارة منخفضة اللخنية M. (للحد من نموها خلال تشتت)، ويستخدم لمرض السل م وكذلك، لا يمكن على الأرجح الأنواع بطيئة النمو أن هزت في درجة حرارة الغرفة دون أي تأثير على النتيجة. يمكن أن تعصف في درجة حرارة الغرفة يكون ضروريا إذا كان يعمل في BSL-3 المرفق.

  1. إعداد محقنة معقمة مزودة microtip (2-200μl) عن طريق خفض نهايته واسع إلى الحجم المناسب، من المناسب أن الحقنة والتغليف مع parafilm. تمرير مضمون كامل للأنبوب عن طريق حقنة طرف المجهزة، وجمع في أنابيب 1 15mL الطازجة. كرر هذه الخطوة 5 إلى 6 مرات حتى كنت مراقبة وقف متجانسة إلى حد ما.
  2. إعداد التخفيفات التسلسلي للتعليق على لوحة والتخفيفات في لوحة 7H11OADC لتحديد عدد من المستعمرات قابلة للتطبيق في كل بئر. احتضان لوحات لمدة ثلاثة أسابيع في الحاضنة 37 درجة مئوية. تحديد الترددقبرصي من صوامد في عدد السكان بيوفيلم عن طريق حساب نسبة من عدد من المستعمرات التي تم الحصول عليها في المضادات الحيوية المعالجة لتلك التي حصلنا عليها في مذيب لوحات المعالجة.

4. ممثل النتائج

عندما تربيتها في زجاجة، والنمو من م. ويمكن رؤية مرض السل في قاعدة الزجاجة بحلول نهاية الأسبوع الأول. في نهاية الأسبوع الثاني، يمكن أن ينظر نمو غير مكتمل من البكتيريا في الهواء واجهة وسائل الإعلام، على الرغم من النمو في الهواء واجهة وسائل الإعلام مرئيا دائما في نهاية الأسبوع الثالث (الشكل 1A). في هذا الوقت لوحظ أيضا المرفق من البكتيريا على جدار الوعاء. من هذه النقطة وصاعدا نمو ثقافة يحدث في المقام الأول على واجهة الهواء وسائل الاعلام. السائل تحت سطح نمو واضح. عادة، وهيكل نضوج بحلول نهاية الأسبوع الخامس (الشكل 1B). إذا الحضانة لفترات طويلة، وسوف تبدأ في الهياكل تنزل الى قاع الإناء. يثير الاهتمام والفضول،تشديد الحد الأقصى حتى نهاية الأسبوع الثالث هو خطوة هامة في هذه العملية، وذلك لأسباب غير معروفة زجاجة فضفاض وتوج يؤخر بشكل كبير الشروع في النمو على واجهة 9.

في شكل 12-جيدا، وينظر إلى بيوفيلم قوي في الهواء واجهة وسائل الإعلام في كل من الآبار في نهاية خمسة اسابيع (الشكل 2A). إذا لم يتم لف لوحات تماما بعد ذلك لوحظ الفرق نمو بيوفيلم. في أسوأ الحالات، يمكن أن مهمة وسائل الإعلام تبخر المماطلة في نمو البكتيريا (الشكل 2B). وبالتالي، التفاف من لوحة من الضروري على حد سواء لمنع التبخر وكذلك لتوفير البيئة لتشكيل بيوفيلم (انظر الفقرة السابقة).

عدد عصيات قادرة على البقاء في الأغشية الحيوية يحدد مع هذا الأسلوب هو تكرار للغاية. استجابة من M. السل الأغشية الحيوية يختلف مع طبيعة من المضادات الحيوية. للحصول على المضادات الحيوية للجراثيم مثل الريفامبيسين، وفقدان القدرة على الاستمرار في أعقاب bipha كذا اتجاه 9. الانحدار السريع في جدوى خلال الأيام الثلاثة أو الأربعة الأولى، تليها مرحلة المستمرة التي نسبة مئوية صغيرة من السكان ما زالت المتمردة تماما للمضادات الحيوية بغض النظر عن تركيز المضادات الحيوية أو وقت التعرض. ويبين الشكل 3 عدد عصيات قادرة على البقاء في الأغشية الحيوية ناضجة بعد التعرض لمدة 7 أيام على 50μg/mL (50 مرات أعلى من MIC) من الريفامبيسين.

رقم 1A.
رقم 1A. ظهور في وقت مبكر من م. عصيات السل في الهواء واجهة وسائل الإعلام من البكتيريا بعد 3 أسابيع من الحضانة.

الشكل 1B.
نضجت الشكل 1B. الأغشية الحيوية من م. مرض السل في الهواء واجهة وسائل الإعلام بعد خمسة أسابيع من الحضانة.

820/3820fig2A.jpg "/>
2A الرقم 5 أسابيع الأغشية الحيوية القديمة م. السل نمت في شكل جيد 12.

الرقم 2B.
2B شخصية. محاولة فاشلة لتنمو M. ​​الأغشية الحيوية السل في 12 لوحة من دون parafilm جيدا.

الشكل 3.
الشكل 3. مؤامرة ممثل تبين تواتر صوامد المخدرات متسامح في م. السل الأغشية الحيوية التي تزرع في 12-جيدا شكل والمعرضين لل50μg/mL من الريفامبيسين لمدة سبعة أيام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الدرن (السل)، والناجمة عن الإصابة بمرض السل المتفطرة، لا يزال يشكل خطرا كبيرا على الصحة العامة العالمية. وتشير التقديرات إلى ما يقرب من ثلث سكان العالم مصابون بهذا المرض asymptomatically من قبل الممرض، ونحو 9 ملايين حالة جديدة تظهر في عيادة في كل عام مع أعراض مرض السل النشط، ونحو 1.7 مليون يموتون من هذا المرض كل عام 11. وساهم في المقام الأول من عبء كبير للمرض عن طريق عدم وجود لقاح، والعلاج الكيميائي بالغة التعقيد الذي ينطوي على نظام للأدوية المتعددة تدار على مدى ستة الى تسعة اشهر. ويعزى إلى حد كبير في العلاج الكيميائي لفترات طويلة للتسامح المظهري من جزء من السكان صغيرة من مسببات المرض التي تتطلب التعرض الطويل للمضادات الحيوية 12. في حين تستهدف هذه صوامد هو أمر حاسم لعلاج قصيرة وفعالة من مرض السل، والآليات التي يقوم عليها تطوير هذه صوامد تزال غير واضحة.

معظم الجراثيم speciودعا سطح المجتمعات المتعددة الخلايا المرفقة وفاق في بيئتها الطبيعية تنمو عفويا في تجميعها المصير، الأغشية الحيوية، والتي هي متسامح جدا للمضادات الحيوية 3. في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن الأنواع بالمتفطرات عدة، لديها ميل قوي للنمو في المختبر كما الأغشية الحيوية، والتي توفر المكروية التي تعزز التنمية من صوامد المخدرات متسامح 9،13-15. في حين تنمو بسرعة الأنواع البيئية، مثل م. ويمكن بسهولة اللخنية تشكيل الأغشية الحيوية في صناعة المنظفات الخالية من وسائل الإعلام، فإن تباطؤ النمو المسببة للأمراض الأنواع م. السل تتطلب شروط معينة لتشكيل هياكل متعددة الخلايا 9. منذ M. زراعة يمكن مرض السل في الأغشية الحيوية تقدم نظرة كبيرة في آليات التسامح المخدرات والمثابرة، ونشر بروتوكول مفصلة لزراعة الممرض في الأغشية الحيوية من خلال المصادر المفتوحة ستكون مفيدة بالنسبة للبحوث السل، وخاصة في countr ذات الموارد المحدودةذ.

نحن هنا وصف طريقة متزايد م. مرض السل في الأغشية الحيوية بالتفصيل. ونحن نقدم أيضا على بروتوكول لكسر الأغشية الحيوية، وتحديد عدد عصيات قادرة على البقاء في صفوف السكان. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد عدد صوامد المخدرات التسامح في الثقافة. الخطوات الثلاث الأكثر أهمية في الأغشية الحيوية زراعة هي: 1) اختيار وسائل الإعلام المنظفات الخالية من مناسبة، أغلقت حاوية الثقافة خلال الأسابيع الثلاثة الأولى، وعاء مفتوح للحضانة لاحق. وعلاوة على ذلك، والحفاظ على الحاويات في حالة ترطيب أمر حاسم أيضا لمنع التبخر وسائل الإعلام خلال 5 أسابيع حضانة. وهذا يمكن أن تعوق بشكل كبير من استنساخ النتائج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا ما يكشف.

Acknowledgments

تم تنفيذ العمل بدعم مالي من المعهد الوطني للصحة والجمعية الأمريكية لأمراض الرئة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator VWR international Model # 1923/25
Polystyrene culture bottles Fisher Scientific 03-374-300
12-well tissue culture plate VWR international 62406-165
50-mL conical tubes VWR international 89039-660
Rocker Thermo Fisher Scientific, Inc. 57019-662
Chromatographic refrigerator VWR international 55702-520
petri dish VWR international 25384-342
KH2PO4 (monobasic) EMD Millipore PX1565-1
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
L-asparagine Sigma-Aldrich A4284-100G
citric acid Sigma-Aldrich C1857-100G
ferric ammonium citrate Sigma-Aldrich F5879-100G
glycerol EMD Millipore GX0185-5
NaOH Sigma-Aldrich S8045-500G
ZnSO4 Sigma-Aldrich Z4750-500G
D-pantothenic acid Sigma-Aldrich P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Middlebrook OADC Enrichment BBL 212351
Tween-80 Fisher Scientific T164-500
250mL storage bottle Corning 430281
12 well plates Falcon BD 353043
rifampicin Sigma-Aldrich R3501-1G
methanol JT Baker 9070-05
10mlLsyringe BD Biosciences 301604
1-200μL pipet tips VWR international 89079-458
parafilm M VWR international PM-996
15mL centrifuge tube Greiner Bio-One 188-285
Difco Mycobacteria 7H11 Agar BD Biosciences 283810
NaCl Fisher Scientific BP358-1
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
Na2HPO4 (dibasic) Sigma-Aldrich S0876-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
  2. Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
  3. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  4. Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
  5. Henke, J. M., Bassler, B. L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
  6. Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
  7. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  8. Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
  9. Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
  10. Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
  11. Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
  12. Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
  13. Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
  14. Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
  15. Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).

Tags

علم المناعة، العدد 60،
نمو<em> المتفطرة السلية</em> الأغشية الحيوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K.More

Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms. J. Vis. Exp. (60), e3820, doi:10.3791/3820 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter