Summary
Mycobacterium tuberculosis danner narkotika tolerante biofilm når de dyrkes i visse betingelser. Her beskriver vi metoder til dyrkning af M. tuberkulose biofilm og bestemmer hyppigheden af narkotika tolerante persisters. Disse protokoller vil være nyttige til yderligere undersøgelser i mekanismerne af lægemiddel tolerance i M. tuberkulose.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, det ætiologiske agens for human tuberkulose, har en usædvanlig evne til at overleve mod miljømæssige påvirkninger, herunder antibiotika. Selvom stress tolerance over for M. tuberkulose er en af de sandsynlige bidragydere til 6-måneders lange kemoterapi af tuberkulose 1, de molekylære mekanismer, der ligger til grund for denne egenskab fænotype af patogenet er fortsat uklare. Mange mikrobielle arter har udviklet sig til at overleve i stressende miljøer ved selvsamlende i velorganiseret, der er knyttet overflade, og matrix-indkapslede strukturer, der kaldes biofilm 2-4. Væksten i lokalsamfund synes at være en foretrukken overlevelsesstrategi af mikrober, og opnås ved hjælp af genetiske komponenter, der regulerer overflade fastgørelse, intercellulære kommunikation, og syntese af ekstracellulære polymere stoffer (EPS) 5,6. Tolerancen miljøbelastninger er sandsynligvis lettes ved EPS, og måske af physiologisk tilpasning af individuelle baciller til heterogene mikromiljøer i kompleks arkitektur af biofilm 7.
I en række af de seneste papirer vi fastslået, at M. tuberculosis og Mycobacterium smegmatis har en stærk tilbøjelighed til at vokse i organiserede multicellulære strukturer kaldet biofilm, som kan tåle mere end 50 gange den minimale inhiberende koncentrationer af de antituberkuløse lægemidler isoniazid og rifampicin 8-10. M. tuberkulose, men fængslende kræver specifikke betingelser for at danne modne biofilm, især 09:01 forholdet headspace: medier samt begrænset udveksling af luft med atmosfæren 9. Krav til specialiserede miljøforhold kan muligvis knyttes til det faktum, at M. tuberkulose er en obligat human patogen, og derfor har tilpasset væv miljøer. I denne publikation har vi demonstrere metoder til dyrkning af M. tuberkulosebiofilm i en flaske og en 12-brønds pladeformat, hvilket er bekvemt for bakteriologiske samt genetiske undersøgelser. Vi har beskrevet en protokol for en svækket stamme af M. tuberkulose, mc 2 7000, med deletion i de to loci, panCD og RD1, som er kritiske for in vivo vækst af patogenet 9. Denne stamme kan sikkert bruges i en BSL-2 inddæmning for at forstå den grundlæggende biologi tuberkulose patogenet og dermed undgå kravet om et dyrt BSL-3 anlæg. Fremgangsmåden kan udvides, med passende modifikation i medier, til at vokse biofilm af andre dyrkbar mykobakteriestammer.
Samlet set vil en ensartet protokol af dyrkning af mycobakterielle biofilm hjælpe efterforskerne interesseret i at studere de grundlæggende elastiske egenskaber mykobakterier. Desuden vil en klar og præcis metode til voksende mycobakterielle biofilm også hjælpe den kliniske og farmaceutiske investigators at teste effektiviteten af et potentielt lægemiddel.
Protocol
1. Voksende biofilm af M. tuberkulose i en 250 ml flaske med skruelåg
- Medier præparat: Opløs 0,5 g KH 2PO 4, 0,5 g MgSO4, 4 g L-asparagin, 2 g citronsyre, 0,05 g ferriammoniumcitrat, 60 ml glycerol i 900 ml vand. PH indstilles til 7,0 med NaOH. Autoklaven afkøles og lige før start af forsøget, og der tilsættes sterilt ZnSO4 til en slutkoncentration på 0,1% w / v. Siden mc 2 7000 er en pantothenat auxotrof denne stamme kræver også, pantotensyre på 10μg/mL endelige koncentration.
Bemærk: Dette er en standard sammensætning af Sauton medier anvendes til M. tuberculosis. Imidlertid, hvis det kræves andre specialiserede medier kan også anvendes til andre mycobakteriearter.
- Inoculums forberedelse: Grow M. tuberkulose i 7H9OADC med 0,05% Tween-80 i en uge eller OD600 på 0,7 til 1,0. CUlture kan direkte anvendes som inokulum i en 1:100 fortynding.
- Dispensere 25 ml Sauton medier til en 250 ml skruelåg polystyren flaske (Corning). Tilsættes 250μl af inoculum til mediet, hætten flasken meget tæt og anbringes uforstyrret i en befugtet 37 ° C inkubator i 3 uger. Observere flasken gang hver dag for at sikre, at der ikke er nogen forurening.
- I slutningen af tredje uge, løsne låget på flasken, så yderligere vækst af M. tuberkulose ved grænsefladen. Hvis hætten ikke løsnes på dette stadium derefter utilstrækkelig oxygenkoncentrationen i beholderen vil forsinke yderligere vækst af bakterier.
2. Vækst af M. tuberculosis biofilm i 12-brønds plader
- Forbered medier og inokulum af mc 2 7000 som beskrevet i afsnit A1 og A2.
- Bland 60 ml af medier med 600μl af inokulum. Dispenser 4.5mL af blandingen i hver brønd i pladen. Dæk pladen med låg. Pak pladen flere gange med parafilm. Inkubér pladen uforstyrret i befugtet inkubator ved 37 ° C i 5 uger.
3. Bestemmelse af hyppigheden af narkotika tolerante persisters i M. tuberkulose biofilm
- Grow M. tuberkulose biofilm i en 12-brønds format som beskrevet i afsnit B. Dette vil tage i alt ca 5-uger.
- Når de biofilm er modnet (efter 5 ugers inkubation) injiceres valg af antibiotikum i den ønskede koncentration i mediet nedenunder de biofilm med en mikrospids i en pipette.
Bemærk: Omfanget af medierne under de pellikeler reduceres til omkring 3,0 ml. Så undersøgere bør derfor beregne mængden af lægemiddel.
- Hvirvel pladen forsigtigt, således at antibiotikummet grundigt spredes i mediet. For statistisk signifikante resultater, injicere antibiotisk i fire brønde. Parallelt, injiceres det samme volumen af opløsningsmiddel, i hvilket antibiotikum blev opløst i andre fire brønde, og efterlader de sidste fire brønde i urørt pladen. Dæk pladen med låg og sætte friske lag af parafilm rundt på pladen. Sæt den tilbage i inkubatoren i ønskede periode.
- Ved slutningen af inkubationen, åbne pladen, og der tilsættes Tween-80 til en slutkoncentration på 0,1% (volumen / volumen) i hver af brøndene. Hvirvel hele pladen forsigtigt for ensartet dispergering af detergentet. Inkubér pladen ved stuetemperatur i 15 minutter. Blande indholdet af hver brønd med pipette flere gange, således at hele indholdet kan blive ensartet overføres til en 15 ml konisk rør.
- Vågeblus indholdet af røret ved 4000rpm i 10 minutter ved stuetemperatur. Resuspender pellet i 5 ml frisk vaskebuffer (PBS med 10% glycerol og 0,05% Tween-80). Gentag vaske tre gange. Resuspender pellet i 5 ml vaskepuffer. Hold det på rocker for overnight ved 4 ° C.
Bemærk: Selvom lav temperatur oprindeligt blev udviklet til M. smegmatis (for at minimere dens vækst under dispersion) og anvendt til M. tuberculosis samt kan langsomtvoksende arter sandsynligvis blive rystet ved stuetemperatur uden nogen indvirkning på resultatet. Rocking ved stuetemperatur kan være nødvendigt, hvis arbejde i BSL-3 anlæg.
- Forbered en steril sprøjte forsynet med microtip (2-200 gi), ved at skære sin brede ende til passende størrelse, passer det til sprøjten, og at omkranse dem med parafilm. Før hele indholdet af røret gennem tip-monterede sprøjte og samle i en frisk 15 ml rør. Gentag dette trin 5 til 6 gange, indtil du oplever en forholdsvis homogen suspension.
- Fremstille serielle fortyndinger af suspensionen og pladen fortyndingerne på 7H11OADC plade for at bestemme antallet af levedygtige kolonier i hver brønd. Pladerne inkuberes i tre uger ved 37 ° C inkubator. Bestem frekvensertikker af persisters i biofilmen populationen ved at beregne forholdet mellem antallet af kolonier opnået i antibiotikum behandlet med dem, der opnås på opløsningsmidler behandlede plader.
4. Repræsentative resultater
Når de dyrkes i en flaske, vækst af M. tuberkulose kan ses på bunden af flasken ved udgangen af den første uge. Ved udgangen af den anden uge, kan pletvis vækst af bakterier på luft-medier grænsefladen ses, skønt vækst ved luft-media grænsefladen er konsekvent synlig ved udgangen af den tredje uge (fig. 1A). På dette tidspunkt fastgørelsen af bakterierne til væggen af beholderen er også observeret. Fra dette punkt og fremefter væksten af kulturen først indtræder luft-media-grænsefladen. Væsken under overfladen vækst er klar. Typisk strukturen modnes ved udgangen af den femte uge (fig. 1B). Hvis inkubering er langvarig, vil strukturerne begynder at synke til bunden af beholderen. Interessant nok,stramning af den fælles landbrugspolitik indtil udgangen af tredje uge, er et vigtigt skridt i processen, og af ukendte årsager en løs-udjævnede flaske i væsentlig grad forsinker indledningen af vækst på grænsefladen 9.
I 12-brønds format, er en robust biofilm ved luft-media grænsefladen ses i hver af brøndene ved afslutningen af fem uger (figur 2A). Hvis pladerne ikke bliver pakket fuldstændigt derefter forskellen biofilmvækst observeres. I værste fald kan signifikant medier inddampning stalle væksten af bakterier (figur 2B). Således indpakning af pladen er nødvendig både for at forhindre fordampning såvel som at tilvejebringe miljø for biofilmdannelse (se foregående afsnit).
Antallet af levedygtige bakterier i biofilm bestemmes med denne teknik er ganske reproducerbar. Reaktion af M. tuberkulose biofilm varierer med arten af de antibiotika. For en bakteriedræbende antibiotika, såsom rifampicin, følger tab af levedygtighed en bipha sic tendens 9. Et hurtigt fald i levedygtighed i løbet af de første tre til fire dage efterfulgt af en vedvarende fase, hvor en lille procentdel af befolkningen være fuldstændig genstridige overfor antibiotika uanset koncentrationen af antibiotikummet eller tidspunktet for eksponering. Figur 3 viser antallet af levedygtige bakterier i modne biofilm efter en 7 dages eksponering for 50μg/mL (50 gange højere end MIC) af rifampicin.
Figur 1A. Tidlig udseende M. tuberkulose baciller luft-media grænsefladen af bakterier efter 3 ugers inkubation.
Figur 1B. Modnet biofilm af M. tuberkulose på luft-media grænsefladen efter fem ugers inkubation.
820/3820fig2A.jpg "/>
Figur 2A. 5 uger gamle biofilm af M. tuberkulose dyrket i 12-brønds format.
Figur 2B. Et mislykket forsøg på at dyrke M. tuberculosis biofilm i 12-brønds plade uden parafilm.
Figur 3. Et repræsentativt plot, der viser frekvensen af lægemiddel tolerante persisters i M. tuberkulose biofilm dyrket i 12-brønds format og eksponeret for 50μg/mL af rifampicin i syv dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tuberkulose (TB), forårsaget af infektion med Mycobacterium tuberculosis, er fortsat en stor trussel mod den globale sundhed. Næsten en tredjedel af verdens befolkning skønnes at være asymptomatisk inficeret af patogenet, omkring 9 millioner nye tilfælde dukker op i klinikken hvert år med symptomer på aktiv TB, og omkring 1,7 millioner dør af infektionen hvert år 11. Den store byrde af sygdommen primært bidraget af mangel på en vaccine og en meget kompliceret kemoterapi, der involverer en multidrug regime administreret over seks til ni måneder. Den forlængede kemoterapi hovedsageligt tilskrives fænotypisk tolerance af en lille subpopulation af patogenet, der kræves længere eksponering af antibiotika 12. Mens målrette disse persisters er kritisk for kort og effektiv behandling af tuberkulose, de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af disse persisters er fortsat uklare.
Mest mikrobiel species i deres naturlige habitat spontant vokser i selv-samlet, overflade vedhæftede flercellede samfund kaldet biofilm, som er meget tolerante over for antibiotika 3. For nylig er det blevet vist, at adskillige mycobakterielle arter, har en stærk tilbøjelighed til at vokse in vitro som biofilm, som giver et mikromiljø, der fremmer udviklingen af lægemiddel tolerante persisters 9,13-15. Mens hurtigt voksende miljø-arter, såsom M. smegmatis kan let dannes biofilm i vaske-frie medier, den langsomtvoksende patogene arter M. tuberkulose kræver særlige betingelser for at danne de flercellede strukturer 9. Siden dyrkning M. tuberkulose i biofilm kunne give betydelig indsigt i de mekanismer af narkotika tolerance og vedholdenhed, formidling af en detaljeret protokol til dyrkning af patogenet i biofilm gennem en open source vil være værdifulde for tuberkulose forskning, især i en ressource-begrænset landespecifikkey.
Her beskriver vi fremgangsmåden dyrkning M. tuberkulose i biofilm i detaljer. Vi giver også en protokol til at bryde biofilm og bestemme antallet af levedygtige bakterier i befolkningen. Denne teknik kan anvendes til at bestemme antallet af lægemiddel tolerante persisters i kulturen. De tre mest kritiske trin i dyrkning af biofilm er: 1) valget af et passende rengøringsmiddel-frie medier, lukket kultur container i løbet af de første tre uger, og åben container for efterfølgende inkubation. Endvidere holde beholderen i en befugtet tilstand er også kritisk for at forhindre fordampning af medium i løbet af 5 ugers inkubation. Dette kan i væsentlig vanskeliggør reproducerbarheden af resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev udført med økonomisk støtte fra National Institute for Health and American Lung Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-well tissue culture plate | VWR international | 62406-165 | |
| 50-mL conical tubes | VWR international | 89039-660 | |
| Rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Chromatographic refrigerator | VWR international | 55702-520 | |
| petri dish | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 | |
| 12 well plates | Falcon BD | 353043 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| methanol | JT Baker | 9070-05 | |
| 10mlLsyringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 1-200μL pipet tips | VWR international | 89079-458 | |
| parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
References
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
