Summary
שחפת Mycobacterium מהווה biofilms סמים סובלניים כאשר בתרבית בתנאים מסוימים. כאן אנו מתארים שיטות culturing מ ' שחפת biofilms וקביעת תדירות persisters סמים סובלניים. פרוטוקולים אלה יהיה שימושי למחקרים נוספים לתוך מנגנוני עמידות לתרופה בתוך: מ ' שחפת.
Abstract
Mycobacterium שחפת, סוכן האטיולוגי של שחפת האדם, יש יכולת יוצאת דופן לשרוד כנגד לחצים סביבתיים, כולל אנטיביוטיקה. למרות הלחץ הסובלנות של מ ' שחפת היא אחד התורמים צפוי כימותרפיה 6 חודשים ארוכה של שחפת 1, המנגנונים המולקולריים שבבסיס זה פנוטיפ אופייני הפתוגן עדיין אינן ברורות. מינים רבים של חיידקים פיתחו כדי לשרוד בסביבות מלחיצים על ידי הרכבה עצמית על פני השטח, מאורגן המצורפת, ו מטריקס מבנים כמוס קרא biofilms 2-4. הגידול ביישובים נראה האסטרטגיה המועדפת הישרדות של חיידקים, והיא מושגת באמצעות רכיבים גנטיים המווסתים מצורף משטח, תקשורת אינטר, וסינתזה של חומרים פולימריים תאיים (EPS) 5,6. עמידות ללחץ סביבתי הוא הקל ככל הנראה על ידי EPS, ואולי על ידי physioloההסתגלות של החיידקים gical הפרט microenvironments הטרוגניות בתוך הארכיטקטורה המורכבת של biofilms 7.
בסדרה של מאמרים האחרונות הקמנו כי מ ' שחפת Mycobacterium smegmatis יש נטייה חזקה לגדול מבנים תאיים מאורגנים, קרא biofilms, שיכול לשאת יותר מ -50 פעמים הריכוזים מעכבות מינימלי של שחפת תרופות נוגדות isoniazid ו 8-10 ריפאמפיצין. מ ' השחפת, לעומת זאת, מסקרן דורש תנאים מסוימים כדי ליצור biofilms בוגרים, ב 09:01 יחס מסוים של אמיץ: מדיה, כמו גם חילופי מוגבלת של אוויר עם אווירה 9. דרישות של תנאי סביבה מיוחדים יכול להיות קשור לעובדה מ ' שחפת היא הפתוגן האנושי מחייבים ולכן יש להתאים לסביבות רקמות. בפרסום זה אנו מדגימים שיטות culturing מ ' שחפתbiofilms בבקבוק בתבנית של 12 גם צלחת, שהוא נוח מחקרים בקטריולוגי כמו גם גנטיים. תיארנו פרוטוקול זן מוחלש של מ ' שחפת, mc 2 7000, עם המחיקה בשני לוקוסים, panCD ו RD1, כי הם קריטיים עבור vivo בצמיחה של 9 הפתוגן. זן זה בטוח לשימוש על מנת להבין את הביולוגיה הבסיסית של הפתוגן שחפת וכך למנוע את הדרישה של מתקן BSL-3 יקר הכלה BSL-2. השיטה ניתן להרחיב, עם שינויים מתאימים בתקשורת, לגדול biofilm של מינים אחרים mycobacterial culturable.
באופן כללי, פרוטוקול אחיד של biofilms culturing mycobacterial יעזור לחוקרים המעוניינים ללמוד את המאפיינים הבסיסיים של mycobacteria וגמיש. בנוסף, שיטה ברורה ותמציתית של biofilms mycobacterial גדל גם יעזור Inv קליני התרופותestigators כדי לבחון את היעילות של התרופה הפוטנציאלית.
Protocol
1. Biofilms גידול של מ ' שחפת בבקבוק 250 מ"ל בורג כתרים
- הכנה מדיה: ממיסים 0.5g של KH 2 PO 4, 0.5g של MgSO 4, 4G של Asparagine-L, 2G של חומצת לימון, 0.05g של אמוניום ציטראט Ferric, 60mL של גליצרול ב 900mL של מים. להתאים את ה-pH 7.0 ל עם NaOH. , החיטוי קריר זמן קצר לפני תחילת הניסוי, להוסיף ZnSO סטרילית 4 לריכוז הסופי של 0.1% w / נ מאז 7000 הוא mc 2 auxotroph pantothenate זן זה דורש גם חומצה פנטותנית ב 10μg/mL הריכוז הסופי.
הערה: זהו ההרכב רמת התקשורת של Sauton המשמשים מ שחפת. עם זאת, אם נדרש מדיה מיוחדים אחרים יכולים לשמש גם עבור מינים mycobacterial אחרים.
- הכנה Inoculums: לגדול מ ' שחפת 7H9OADC עם 0.05% Tween-80 למשך שבוע, או 600 OD של 0.7-1.0. מ"קlture ניתן להשתמש ישירות על דילול 1:100 הבידוד.
- לוותר 25mL של התקשורת Sauton כדי בקבוק 250 מ"ל קלקר כתרים בורג (Corning). הוסף 250μl של הבידוד עד בינוני, מכסה את הבקבוק בחוזקה ומניחים אותו ללא הפרעה humidified 37 ° C החממה למשך 3 שבועות. שים את הבקבוק פעם אחת בכל יום על מנת להבטיח כי יש זיהום לא.
- בסוף השבוע השלישי, לשחרר את הפקק של הבקבוק כדי לאפשר צמיחה נוספת של מ ' שחפת על הממשק. אם הכובע לא משוחרר בשלב זה אז ריכוז חמצן מספיק במיכל יהיה לעכב צמיחה נוספת של חיידקים.
2. גידול של מ ' שחפת biofilms ב 12 גם צלחות
- מכינים את התקשורת הבידוד של mc 2 7000, כמתואר בסעיפים A1 ו-A2.
- מערבבים 60mL של התקשורת עם 600μl של הבידוד. לוותר על 4.5mL של התערובת לתוך כל אחד גם הצלחת. מכסים את הצלחת עם מכסה. לעטוף את הצלחת כמה פעמים עם parafilm. דגירה צלחת ללא הפרעה חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שבועות.
3. קביעת תדירות persisters סמים סובלניים בתוך: מ ' שחפת biofilms
- לגדול מ biofilms שחפת בתבנית של 12 גם כמתואר בסעיף ב 'זה ייקח כולל של כ 5-שבועות.
- לאחר biofilms הם התבגר (אחרי 5 שבועות של דגירה) להזריק בחירתך אנטיביוטיקה בריכוז הרצוי לתוך התקשורת שמתחת biofilms באמצעות microtip ב פיפטה.
הערה: היקף בתקשורת מתחת pellicles מפחית בכ 3.0mL. אז החוקרים צריכים בהתאם לחשב את כמות התרופה.
- לערבל את הצלחת בעדינות כך אנטיביוטיקה היא מתפזרת היטב במדיום. לקבלת תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, להזריק antibiotic ארבע בארות. במקביל, להזריק באותו נפח של הממס שבו אנטיביוטיקה פורקה בארבע בארות אחרות, ולהשאיר האחרונים ארבע בארות של צלחת ללא שינוי. מכסים את הצלחת עם מכסה ולשים שכבות חדשות של parafilm סביב הצלחת. מניחים אותו בחזרה חממה פרק הזמן הרצוי.
- בסוף הדגירה, פתח את צלחת ולהוסיף Tween-80 לריכוז הסופי של 0.1% (נפח / נפח) בכל אחת הבארות. לערבל את כל הצלחת בעדינות לפיזור אחיד של חומר ניקוי. דגירה צלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מערבבים היטב את התוכן של כל אחד מהם מספר פעמים פיפטה כך התוכן ניתן להעביר באופן אחיד על צינור חרוטי 15 מ"ל.
- לסובב את התוכן של הצינור על 4000rpm במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ לשטוף טרי (PBS עם גליצרול 10% ו 0.05% tween-80). חזור על כביסה שלוש פעמים. Resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ הכביסה. שמור את זה על כיסא הנדנדה של overnight ב 4 ° C.
הערה: למרות הטמפרטורה הנמוכה פותחה במקור עבור מ 'smegmatis (כדי למזער את צמיחתה במהלך פיזור) ושימשו שחפת מ' גם כן, מינים הגדלים איטי יכול כנראה להיות התנדנד בטמפרטורת החדר מבלי להשפיע על התוצאה. נדנדה בטמפרטורת החדר יכול להיות הכרחי אם עובדים במתקן BSL-3.
- להכין מזרק סטרילי מצויד microtip (2-200μl) על ידי חיתוך קצה הרחב לגודל מתאים, הולם אותו מזרק, וכרך אותו עם parafilm. להעביר את כל התוכן של הצינור באמצעות מזרק קצה מצויד ולאסוף בעוד כמה צינורות 15 מ"ל טריים. חזור על שלב 5 עד 6 פעמים עד שאתה רואה ההשעיה הומוגנית למדי.
- הכינו סדרה של דילולים ההשעיה ואת הצלחת דילולים על הצלחת 7H11OADC כדי לקבוע את מספר מושבות קיימא ב היטב כל אחד מהם. דגירה צלחות במשך שלושה שבועות 37 ° C חממה. קבע את frequenלסי של persisters באוכלוסייה biofilm על ידי חישוב היחס בין מספר המושבות שהתקבלו טיפול אנטיביוטי לאלו שהושגו על צלחות שטופלו ממס.
4. נציג תוצאות
כאשר בתרבית בבקבוק, גידול של מ ' שחפת ניתן לראות בבסיס הבקבוק עד סוף השבוע הראשון. בסוף השבוע השני, צמיחה של חיידקים בלתי סדיר על ממשק האוויר התקשורת ניתן לראות, אם כי הצמיחה בממשק אוויר מדיה גלוי באופן עקבי בסוף השבוע השלישי (איור 1 א). בשלב זה החיבור של החיידקים לדופן המיכל הוא ציין גם. מנקודה זו ואילך הצמיחה של התרבות מתרחשת בעיקר על ממשק האוויר בתקשורת. נוזלים מתחת לפני השטח הצמיחה הוא ברור. בדרך כלל, מבנה מתבגר עד סוף השבוע 5 (איור 1 ב). אם הדגירה ממושכת, מבנים יתחילו לשקוע בתחתית המיכל. מעניין לגלותהידוק המכסה עד סוף השבוע השלישי הוא שלב חשוב בתהליך, ומסיבות לא ידועות בקבוק רופף הכתיר מפגרים באופן משמעותי את תחילת הצמיחה בממשק 9.
בתבנית של 12 היטב, biofilm חזק על הממשק אוויר התקשורת נתפסת בכל אחת הבארות בתום חמישה שבועות (איור 2 א). אם הצלחות אינן לכיסוי מלא ואז הצמיחה biofilm ההפרש הוא ציין. במקרה הגרוע ביותר, משמעותית אידוי התקשורת יכול לעכב את הצמיחה של החיידקים (איור 2 ב). לכן, גלישת הצלחת יש גם כדי למנוע אידוי וגם כדי לספק סביבה ליצירת biofilm (ראה סעיף קודם).
מספר החיידקים קיימא biofilms שנקבעו עם טכניקה זו היא לשחזור למדי. תגובת מ ' שחפת biofilms משתנה אופיו של אנטיביוטיקה. על אנטיביוטיקה bactericidal כגון ריפאמפיצין, אובדן הכדאיות כדלקמן bipha כך במקור מגמה 9. ירידה מהירה של כדאיות במשך שלושה עד ארבעה ימים הראשונים ואחריהם שלב מתמשך שבו אחוז קטן מהאוכלוסייה נשאר הסרבן לחלוטין לאנטיביוטיקה ללא קשר ריכוז של אנטיביוטיקה או זמן החשיפה. איור 3 מציג את מספר החיידקים קיימא biofilms בוגרים לאחר חשיפה 7 ימים כדי 50μg/mL (50 פעמים גבוה יותר מאשר MIC) של ריפאמפיצין.
איור 1 א. הופעה מוקדמת של מ ' שחפת החיידקים בממשק אוויר התקשורת של החיידקים לאחר 3 שבועות של דגירה.
איור 1 ב. התבגר biofilms של מ ' שחפת בממשק אוויר התקשורת לאחר חמישה שבועות של דגירה.
820/3820fig2A.jpg "/>
איור 2 א. 5 שבועות biofilms הישנים של מ ' שחפת גדל בתבנית של 12 גם כן.
איור 2 ב. ניסיון כושל לגדל יג biofilms שחפת בצלחת 12 גם בלי parafilm.
איור 3. העלילה נציג מראה את שכיחות persisters סמים סובלניים בתוך: מ ' שחפת biofilms גדל בתבנית של 12 היטב חשופים 50μg/mL של ריפאמפיצין במשך שבעה ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שחפת (TB), נגרמת על ידי זיהום של Mycobacterium שחפת, נותר איום משמעותי על בריאות הציבור העולמית. כמעט שליש מאוכלוסיית העולם מוערך להידבק asymptomatically ידי פתוגן, כ -9 מיליון מקרים חדשים מופיעים במרפאה כל שנה עם תסמינים של שחפת פעילה על 1,700,000 מתים מזיהום מדי שנה 11. נטל עצום של המחלה תרם בעיקר על ידי חוסר החיסון ואת כימותרפיה מסובך מאוד כי מדובר במשטר multidrug מנוהל על שישה עד תשעה חודשים. כימותרפיה ממושכת מיוחסת במידה רבה סובלנות פנוטיפי של subpopulation קטנה של הפתוגן שדרשה חשיפה ממושכת של אנטיביוטיקה 12. תוך מיקוד אלה persisters הוא קריטי לטיפול קצר ויעיל של שחפת, המנגנונים העומדים בבסיס הפיתוח של persisters אלה עדיין אינן ברורות.
חיידקים ביותר species בסביבתם הטבעית באופן ספונטני לגדול עצמית התאספו, מצורפים השטח קהילות תאיים בשם biofilms, שהם סובלניים מאוד אנטיביוטיקה 3. לאחרונה, הוכח כי מספר מינים mycobacterial, יש נטייה חזקה לגדול במבחנה כמו biofilms, המספקים microenvironment כי לקדם את הפיתוח של תרופות persisters סובלניים 9,13-15. בעוד גדל מהר מינים סביבתיים כגון מ ' smegmatis יכול בקלות ליצור biofilms של חומר ניקוי ללא מדיה, גידול איטי מינים פתוגניים מ ' שחפת דורשים תנאים ספציפיים ליצירת מבנים תאיים 9. מאז culturing מ ' שחפת biofilms יכול לספק תובנה משמעותית לתוך המנגנונים של סובלנות והתמדה סמים, הפצת פרוטוקול מפורט עבור culturing הפתוגן ב biofilms דרך מקור פתוח יהיה יקר לחקר מחלת השחפת, במיוחד countr משאב מוגבלy.
כאן אנו מתארים את שיטת גידול מ ' שחפת biofilms בפירוט. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול לשבור את biofilms ולקבוע את מספר החיידקים קיימא באוכלוסייה. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לקבוע את מספר persisters סמים סובלניים בתרבות. שלושת השלבים הקריטיים ביותר biofilms culturing הם: 1) בחירה של עם חומרי ניקוי ללא התקשורת המתאימים, סגרה מיכל התרבות במהלך שלושת השבועות הראשונים, ואת מיכל פתוח הדגירה לאחר מכן. יתר על כן, שמירה על מיכל במצב humidified חיוני גם כדי למנוע אידוי של התקשורת במהלך הדגירה 5 שבועות. זה יכול לעכב באופן משמעותי שחזור של התוצאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
העבודה בוצעה עם תמיכה כספית מהמכון הלאומי לבריאות האמריקאי איגוד הריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-well tissue culture plate | VWR international | 62406-165 | |
| 50-mL conical tubes | VWR international | 89039-660 | |
| Rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Chromatographic refrigerator | VWR international | 55702-520 | |
| petri dish | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 | |
| 12 well plates | Falcon BD | 353043 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| methanol | JT Baker | 9070-05 | |
| 10mlLsyringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 1-200μL pipet tips | VWR international | 89079-458 | |
| parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
References
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
