שחפת Mycobacterium מהווה biofilms סמים סובלניים כאשר בתרבית בתנאים מסוימים. כאן אנו מתארים שיטות culturing מ ' שחפת biofilms וקביעת תדירות persisters סמים סובלניים. פרוטוקולים אלה יהיה שימושי למחקרים נוספים לתוך מנגנוני עמידות לתרופה בתוך: מ ' שחפת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Mycobacterium שחפת, סוכן האטיולוגי של שחפת האדם, יש יכולת יוצאת דופן לשרוד כנגד לחצים סביבתיים, כולל אנטיביוטיקה. למרות הלחץ הסובלנות של מ ' שחפת היא אחד התורמים צפוי כימותרפיה 6 חודשים ארוכה של שחפת 1, המנגנונים המולקולריים שבבסיס זה פנוטיפ אופייני הפתוגן עדיין אינן ברורות. מינים רבים של חיידקים פיתחו כדי לשרוד בסביבות מלחיצים על ידי הרכבה עצמית על פני השטח, מאורגן המצורפת, ו מטריקס מבנים כמוס קרא biofilms 2-4. הגידול ביישובים נראה האסטרטגיה המועדפת הישרדות של חיידקים, והיא מושגת באמצעות רכיבים גנטיים המווסתים מצורף משטח, תקשורת אינטר, וסינתזה של חומרים פולימריים תאיים (EPS) 5,6. עמידות ללחץ סביבתי הוא הקל ככל הנראה על ידי EPS, ואולי על ידי physioloההסתגלות של החיידקים gical הפרט microenvironments הטרוגניות בתוך הארכיטקטורה המורכבת של biofilms 7.
בסדרה של מאמרים האחרונות הקמנו כי מ ' שחפת Mycobacterium smegmatis יש נטייה חזקה לגדול מבנים תאיים מאורגנים, קרא biofilms, שיכול לשאת יותר מ -50 פעמים הריכוזים מעכבות מינימלי של שחפת תרופות נוגדות isoniazid ו 8-10 ריפאמפיצין. מ ' השחפת, לעומת זאת, מסקרן דורש תנאים מסוימים כדי ליצור biofilms בוגרים, ב 09:01 יחס מסוים של אמיץ: מדיה, כמו גם חילופי מוגבלת של אוויר עם אווירה 9. דרישות של תנאי סביבה מיוחדים יכול להיות קשור לעובדה מ ' שחפת היא הפתוגן האנושי מחייבים ולכן יש להתאים לסביבות רקמות. בפרסום זה אנו מדגימים שיטות culturing מ ' שחפתbiofilms בבקבוק בתבנית של 12 גם צלחת, שהוא נוח מחקרים בקטריולוגי כמו גם גנטיים. תיארנו פרוטוקול זן מוחלש של מ ' שחפת, mc 2 7000, עם המחיקה בשני לוקוסים, panCD ו RD1, כי הם קריטיים עבור vivo בצמיחה של 9 הפתוגן. זן זה בטוח לשימוש על מנת להבין את הביולוגיה הבסיסית של הפתוגן שחפת וכך למנוע את הדרישה של מתקן BSL-3 יקר הכלה BSL-2. השיטה ניתן להרחיב, עם שינויים מתאימים בתקשורת, לגדול biofilm של מינים אחרים mycobacterial culturable.
באופן כללי, פרוטוקול אחיד של biofilms culturing mycobacterial יעזור לחוקרים המעוניינים ללמוד את המאפיינים הבסיסיים של mycobacteria וגמיש. בנוסף, שיטה ברורה ותמציתית של biofilms mycobacterial גדל גם יעזור Inv קליני התרופותestigators כדי לבחון את היעילות של התרופה הפוטנציאלית.
פרוטוקול
1. Biofilms גידול של מ ' שחפת בבקבוק 250 מ"ל בורג כתרים
- הכנה מדיה: ממיסים 0.5g של KH 2 PO 4, 0.5g של MgSO 4, 4G של Asparagine-L, 2G של חומצת לימון, 0.05g של אמוניום ציטראט Ferric, 60mL של גליצרול ב 900mL של מים. להתאים את ה-pH 7.0 ל עם NaOH. , החיטוי קריר זמן קצר לפני תחילת הניסוי, להוסיף ZnSO סטרילית 4 לריכוז הסופי של 0.1% w / נ מאז 7000 הוא mc 2 auxotroph pantothenate זן זה דורש גם חומצה פנטותנית ב 10μg/mL הריכוז הסופי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שחפת (TB), נגרמת על ידי זיהום של Mycobacterium שחפת, נותר איום משמעותי על בריאות הציבור העולמית. כמעט שליש מאוכלוסיית העולם מוערך להידבק asymptomatically ידי פתוגן, כ -9 מיליון מקרים חדשים מופיעים במרפאה כל שנה עם תסמינים של שחפת פעילה על 1,700,000 מתים מזיהום מדי שנה 11. נטל עצום של המחלה תרם בעיקר על ידי חוסר החיסון ואת כימותרפיה מסובך מאוד כי מדובר במשטר multidrug מנוהל על שישה עד תשעה חודשים. כימותרפיה ממושכת מיוחסת במידה רבה סובלנות פנוטיפי של subpopulatio.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו מה למסור.
תודות
העבודה בוצעה עם תמיכה כספית מהמכון הלאומי לבריאות האמריקאי איגוד הריאות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אינקובטור | VWR international | Model # 1923/25 | |
| בקבוקי תרבית מפוליסטירן | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| פלטת תרבית רקמה בעלת 12 בארות | VWR international | 62406-165 | |
| מבחנות קוניות בנפח 50-mL | VWR international | 89039-660 | |
| רוקר (מנער) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| מקרר כרומטוגרפי | VWR international | 55702-520 | |
| צלחת פטרי | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (מונובסי) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| חומצה ציטרית | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| גליצרין | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| מצע Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| בקבוק אחסון בנפח 250mL | Corning | 430281 | |
| פלטות בעלות 12 בארות | Falcon BD | 353043 | |
| ריפמפיצין | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| מתנול | JT Baker | 9070-05 | |
| מזרק בנפח 10ml | BD Biosciences | 301604 | |
| טיפים לפיפט של 1-200μL | VWR international | 89079-458 | |
| parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| מבחנה לצנטריפוגה בנפח 15mL | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| מצע Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (דיבסי) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
מקורות
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
