Микобактерий туберкулеза лекарственных форм терпимо биопленки при культивировании в определенных условиях. Здесь мы опишем методы культивирования M. туберкулез биопленки и определения частоты наркотиков терпимо persisters. Эти протоколы будут полезны для дальнейших исследований в механизмах толерантности препарата в М. туберкулезом.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Рост Микобактерий туберкулеза Биопленки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Mycobacterium tuberculosis, этиологический агент туберкулеза человека, обладает исключительной способностью выживать в условиях воздействия стрессовых факторов окружающей среды, включая воздействие антибиотиков. Хотя устойчивость M. tuberculosis к стрессу, вероятно, является одним из факторов, обуславливающих необходимость 6-месячного курса химиотерапии туберкулеза 1, молекулярные механизмы, лежащие в основе этого характерного фенотипа патогена, остаются неясными. Многие виды микроорганизмов в ходе эволюции приспособились к выживанию в стрессовых условиях путем самоорганизации в высокоструктурированные, прикрепленные к поверхности и заключенные в матрикс образования, называемые биопленками 2-4. Рост в сообществах, по-видимому, является предпочтительной стратегией выживания микробов и обеспечивается генетическими компонентами, которые регулируют прикрепление к поверхности, межклеточную коммуникацию и синтез внеклеточных полимерных веществ (ВПВ) 5,6. Устойчивость к стрессу окружающей среды, вероятно, обеспечивается ВПВ и, возможно, физиологической адаптацией отдельных бацилл к гетерогенным микросредам внутри сложной архитектуры биопленок 7.
В серии недавних работ мы установили, что M. tuberculosis и Mycobacterium smegmatis обладают сильной склонностью к росту в виде организованных многоклеточных структур, называемых биопленками, которые могут выдерживать концентрации противотуберкулезных препаратов изониазида и рифампицина, более чем в 50 раз превышающие минимальные ингибирующие концентрации 8-10. Однако, что примечательно, для формирования зрелых биопленок M. tuberculosis требуются специфические условия, в частности соотношение объема над фазой среды к объему самой среды 9:1, а также ограниченный газообмен с атмосферой 9. Потребность в специальных условиях окружающей среды, возможно, связана с тем, что M. tuberculosis является облигатным патогеном человека и, следовательно, адаптирован к тканевой среде. В данной публикации мы демонстрируем методы культивирования биопленок M. tuberculosis во флаконах и в формате 12-луночного планшета, что удобно как для бактериологических, так и для генетических исследований. Мы описали протокол для аттенуированного штамма M. tuberculosis, mc27000, с делециями в двух локусах panCD и RD1, которые имеют решающее значение для роста патогена in vivo 9. Этот штамм может быть безопасно использован в условиях уровня биобезопасности BSL-2 для изучения фундаментальной биологии возбудителя туберкулеза, что позволяет избежать необходимости использования дорогостоящих лабораторий уровня BSL-3. Данный метод может быть расширен при соответствующей модификации состава среды для выращивания биопленок других культивируемых видов микобактерий.
В целом, единый протокол культивирования микобактериальных биопленок поможет исследователям, заинтересованным в изучении основных характеристик устойчивости микобактерий. Кроме того, четкий и лаконичный метод выращивания микобактериальных биопленок поможет клиническим и фармацевтическим специалистам в тестировании эффективности потенциальных лекарственных препаратов.
Протокол
1. Рост биопленки М. туберкулезом в 250 мл винт крышками бутылки
- СМИ приготовления: Растворите 0,5 г KH 2 PO 4, 0,5 г MgSO 4, 4 г L-аспарагин, 2 г лимонной кислоты, 0,05 г железа цитрат аммония, 60 мл глицерина в 900 мл воды. Скорректировать значение рН до 7,0 с NaOH. Автоклав, остудить и только до начала эксперимента, добавить стерильный ZnSO 4 до конечной концентрации 0,1% вес / С mс 2 7000 пантотенат ауксотроф этого штамма также требует пантотеновой кислоты в 10μg/mL конечной концентрации.
Примечание: Это стандартный состав СМИ Sauton, использ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Туберкулез (ТБ), вызванный в заражении микобактериями туберкулеза, остается серьезной угрозой для общественного здравоохранения. Почти одна треть населения в мире, по оценкам, бессимптомно инфицированных возбудителем, около 9 миллионов новых случаев заболевания появляются в клинике каждый год с признаками активной формой туберкулеза и около 1,7 миллиона умирают от инфекций каждый год 11. Огромная тяжесть заболевания, в первую очередь способствовали отсутствием вакцины и очень сложный химиотерапии, чт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке Национального института здравоохранения и Американской легочной ассоциации.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Инкубатор | VWR international | Модель № 1923/25 | |
| Полистирольные культуральные флаконы | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-луночный планшет для культивирования тканей | VWR international | 62406-165 | |
| Конические пробирки объемом 50 mL | VWR international | 89039-660 | |
| Шейкер-рокер | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Хроматографический холодильник | VWR international | 55702-520 | |
| Чашка Петри | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (однозамещенный) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-аспарагин | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| Лимонная кислота | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| Цитрат аммония-железа(III) | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| Глицерин | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-пантотеновая кислота | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Бульон Middlebrook 7H9 от Difco | BD Biosciences | 271310 | |
| Обогатительная добавка OADC Middlebrook | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Бутыль для хранения объемом 250 mL | Corning | 430281 | |
| 12-луночные планшеты | Falcon BD | 353043 | |
| Рифампицин | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Метанол | JT Baker | 9070-05 | |
| Шприц объемом 10 mL | BD Biosciences | 301604 | |
| Наконечники для пипеток 1-200μL | VWR international | 89079-458 | |
| Parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| Центрифужная пробирка объемом 15 mL | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Агар Mycobacteria 7H11 от Difco | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (двузамещенный) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
Ссылки
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
