Summary
Микобактерий туберкулеза лекарственных форм терпимо биопленки при культивировании в определенных условиях. Здесь мы опишем методы культивирования M. туберкулез биопленки и определения частоты наркотиков терпимо persisters. Эти протоколы будут полезны для дальнейших исследований в механизмах толерантности препарата в М. туберкулезом.
Protocol
1. Рост биопленки М. туберкулезом в 250 мл винт крышками бутылки
- СМИ приготовления: Растворите 0,5 г KH 2 PO 4, 0,5 г MgSO 4, 4 г L-аспарагин, 2 г лимонной кислоты, 0,05 г железа цитрат аммония, 60 мл глицерина в 900 мл воды. Скорректировать значение рН до 7,0 с NaOH. Автоклав, остудить и только до начала эксперимента, добавить стерильный ZnSO 4 до конечной концентрации 0,1% вес / С mс 2 7000 пантотенат ауксотроф этого штамма также требует пантотеновой кислоты в 10μg/mL конечной концентрации.
Примечание: Это стандартный состав СМИ Sauton, используемой для микобактерий туберкулеза. Однако, в случае необходимости другие специализированные средства массовой информации могут также быть использованы для других видов микобактерий.
- Inoculums подготовки: Расти М. туберкулезом в 7H9OADC с 0,05% Твин-80 в течение одной недели, или OD 600 от 0,7 до 1,0. У.е.lture могут быть непосредственно использованы в качестве посевного в разведении 1:100.
- Внесите 25 мл СМИ Sauton на 250 мл винт крышками бутылки полистирола (Corning). Добавить 250 мкл посевного в среду, крышка очень плотно бутылку и поместите его спокойно, в увлажненной 37 ° C инкубаторе в течение 3 недель. Обратите внимание на бутылку раз в день, чтобы обеспечить, что нет загрязнений.
- В конце третьей недели, ослабьте крышку бутылки, чтобы дальнейший рост M. туберкулезом на границе. Если крышка не ослабил на данном этапе, то недостаточная концентрация кислорода в контейнере будет тормозить дальнейший рост бактерий.
2. Рост М. туберкулез биопленки в 12-луночных
- Подготовка информации и посевной тс 2 7000, как описано в разделе A1 и A2.
- Смешайте 60 мл среды с 600μl инокулята. Внесите 4,5L смеси в каждую лунку пластинки. Закройте планшет крышкой. Оберните пластинка несколько раз парафильмом. Инкубируйте планшет спокойно в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 5 недель.
3. Определение частоты лекарственной терпимо persisters в М. туберкулез биопленки
- Рост М. туберкулез биопленки в 12-луночного формата, как описано в разделе B. Это займет в общей сложности около 5-ти недель.
- После биопленки созрела (после 5 недель инкубации) вводить ваш выбор антибиотика в нужной концентрации в средствах массовой информации под биопленки помощью микроострийных в пипетку.
Примечание: Объем средств массовой информации под пленок уменьшается примерно 3.0mL. Таким образом, исследователи должны соответственно рассчитать количество препарата.
- Swirl пластины аккуратно, чтобы антибиотик полностью распространяется в среде. Для статистически значимые результаты, впрыскивают антибиотиковслуховым в четырех скважин. Параллельно вводят тот же объем растворителя, в котором антибиотик был распущен и в других четырех скважин, а также оставить за последние четыре скважины пластины нетронутыми. Закройте планшет крышкой и поставить свежие слои парафильмом вокруг плиты. Положите ее обратно в инкубатор для желаемого периода времени.
- В конце инкубации, откройте плиты и добавить Твин-80 в конечной концентрации 0,1% (объем / объем) в каждой из скважин. Swirl целую тарелку мягко для равномерного рассеивания моющего средства. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 15 минут. Смешать содержимое каждой лунки с пипетки несколько раз, так что весь контент может быть равномерно передается 15 мл коническую трубку.
- Спином вниз содержимое тубы на 4000rpm в течение 10 минут при комнатной температуре. Ресуспендируют гранул в 5 мл свежего промывочным буфером (PBS с 10% глицерина и 0,05% Твин-80). Повторите мытье в три раза. Ресуспендируют гранул в 5 мл промывочного буфера. Держите его на коромысло для оvernight при 4 ° C.
Примечание: Несмотря на низкую температуру первоначально была разработана для М. smegmatis (для уменьшения его роста в дисперсии) и используется для микобактерий туберкулеза, а также, медленно растущих видов может, скорее всего, качал при комнатной температуре без какого-либо влияния на результат. Раскачивание при комнатной температуре может быть необходимо, если работать в BSL-3 объекта.
- Подготовка стерильного шприца снабжены микроострийных (2 200 мкл) за счет сокращения его широкий конец в подходящий размер, установка его в шприц и, окружив его с парафильмом. Передать все содержимое трубки через зонд-оборудованная шприц и собирать в свежем 15 мл пробирки. Повторите этот шаг 5 до 6 раз, пока не наблюдается довольно однородной суспензии.
- Подготовка серийного разведения подвески и пластины разведения на 7H11OADC пластины для определения количества жизнеспособных колоний в каждую лунку. Инкубируйте пластины в течение трех недель в 37 ° C инкубатора. Определение частотыСай о persisters в биопленки населения путем расчета соотношения числа колоний, полученных в лечение антибиотиком, полученным на растворитель рассматривается пластин.
4. Представитель Результаты
При культивировании в бутылке, рост M. туберкулез можно увидеть на базе бутылку к концу первой недели. К концу второй недели, пятнистый рост бактерий в эфире информации интерфейс можно увидеть, хотя рост на воздушной среды интерфейс постоянно видимый в конце третьей недели (рис. 1А). В это время прикрепления бактерии к стенке контейнера наблюдается. С этого момента рост культуры в первую очередь происходит в эфире информации интерфейсом. Жидкости под поверхностью рост очевиден. Как правило, структура созревает к концу пятой недели (рис. 1б). Если инкубация удлиняется, структуры начнут опускаться на дно контейнера. Интересно, чтоужесточение крышку до конца третьей недели, является важным шагом в процессе, и по неизвестным причинам свободные крышками бутылки значительно задерживает начало роста на границе 9.
В 12-луночного формата, надежные биопленки на воздушной среды интерфейс видел в каждом из скважины в конце пять недель (рис. 2A). Если пластины не полностью обернут то дифференциальный рост биопленки не наблюдается. В худшем случае, значительное испарение средства массовой информации могут остановить рост бактерий (рис. 2В). Таким образом, упаковка пластины необходимо как для предотвращения испарения, а также обеспечить условия для формирования биопленок (см. предыдущий абзац).
Количество жизнеспособных бактерий в биопленках определяется с помощью этой техники достаточно воспроизводимыми. Ответ М. туберкулез биопленки зависит от природы антибиотиков. Для бактерицидными антибиотиками, такие как рифампицин, потеря жизнеспособности следующим bipha оригинале тенденции 9. Быстрое снижение жизнеспособности в течение первых трех-четырех дней с последующим постоянным фаза, в которой небольшая часть населения по-прежнему полностью непокорных к антибиотикам, независимо от концентрации антибиотиков и времени экспозиции. На рисунке 3 показано количество жизнеспособных бактерий в зрелые биопленки после 7-дневного воздействия 50μg/mL (в 50 раз выше, чем МИК) рифампицин.
Рисунок 1А. Раннее появление М. туберкулез бактерии в эфире информации интерфейс бактерий через 3 недели инкубации.
Рисунок 1B. Выдержанная биопленки М. туберкулеза в эфире информации интерфейса после пяти недель инкубации.
820/3820fig2A.jpg "/>
Рисунок 2А. 5-недельных биопленки М. туберкулезом выросла в 12-и формата.
Рисунок 2B. Неудачной попытки роста микобактерий туберкулеза биопленки в 12-луночного планшета без парафильмом.
Рисунок 3. Представитель график, показывающий частоту наркотиков терпимо persisters в М. туберкулез биопленок, выращенных в 12-луночного формата и подвергаются 50μg/mL рифампицина в течение семи дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Туберкулез (ТБ), вызванный в заражении микобактериями туберкулеза, остается серьезной угрозой для общественного здравоохранения. Почти одна треть населения в мире, по оценкам, бессимптомно инфицированных возбудителем, около 9 миллионов новых случаев заболевания появляются в клинике каждый год с признаками активной формой туберкулеза и около 1,7 миллиона умирают от инфекций каждый год 11. Огромная тяжесть заболевания, в первую очередь способствовали отсутствием вакцины и очень сложный химиотерапии, что связано с множественной лекарственной режим вводят в течение шести-девяти месяцев. Длительное химиотерапии в значительной степени объясняется фенотипические толерантности небольшой субпопуляции возбудителя, что необходимо длительное воздействие антибиотиков 12. Хотя эти ориентации persisters имеет решающее значение для короткого и эффективного лечения туберкулеза, механизмы, лежащие в основе развития этих persisters остаются неясными.
Большинство микробных образцах годов в их естественной среде обитания спонтанно растут в самоорганизующихся, поверхность прилагается многоклеточных общины называют биопленки, которые очень устойчивы к антибиотикам 3. Недавно было показано, что несколько видов микобактерий, имеют сильную склонность расти в пробирке, как биопленки, которые обеспечивают микросреды, которые способствуют развитию лекарственной терпимо persisters 9,13-15. В то время как быстро растущие экологические виды, такие как М. smegmatis легко образуют биопленки в производстве моющих средств, свободных средств массовой информации, медленный рост патогенных видов M. туберкулезом требуют специальных условий для формирования многоклеточных структур 9. После культивирования M. туберкулезом в биопленок может обеспечить значительную информацию о механизмах толерантности наркотиков и настойчивость, распространение подробный протокол для культивирования возбудителя в биопленки через открытым исходным кодом будет иметь большое значение для исследования туберкулеза, особенно в условиях ограниченных ресурсов Кантру.
Здесь мы опишем метод выращивания М. туберкулезом в биопленки в деталях. Мы также предоставляем протокол разбить биопленки и определения количества жизнеспособных бактерий в популяции. Эта техника может быть использована для определения количества наркотиков терпимо persisters в культуре. Три наиболее важных шагов в культивировании биопленки являются: 1) выбор подходящего моющего средства, свободные средства массовой информации, закрытой культурой контейнере в течение первых трех недель, и открытый контейнер для последующей инкубации. Кроме того, хранение контейнера в увлажненном условием является также решающее значение для предотвращения испарения средств массовой информации в течение 5 недель инкубации. Это может существенно затруднять воспроизводимость результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Работа выполнена при финансовой поддержке Национального института здравоохранения и Американской легочной ассоциации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-well tissue culture plate | VWR international | 62406-165 | |
| 50-mL conical tubes | VWR international | 89039-660 | |
| Rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Chromatographic refrigerator | VWR international | 55702-520 | |
| petri dish | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 | |
| 12 well plates | Falcon BD | 353043 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| methanol | JT Baker | 9070-05 | |
| 10mlLsyringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 1-200μL pipet tips | VWR international | 89079-458 | |
| parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
References
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
