Summary
Mycobacterium tuberculosis läkemedelsformer toleranta biofilmer när de odlas i vissa villkor. Här beskriver vi metoder för odling M. tuberkulos biofilmer och bestämmer frekvensen av narkotika toleranta persisters. Dessa protokoll kommer att vara användbar för fortsatta studier i mekanismerna av läkemedel tolerans i M. tuberkulos.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, den etiologiska orsaken till människans tuberkulos, har en extraordinär förmåga att överleva mot miljöpåfrestningar inklusive antibiotika. Även stresstolerans av M. tuberkulos är en av de troliga bidragsgivarna till den 6-månader långa kemoterapi av tuberkulos 1, de molekylära mekanismerna bakom denna egenskap fenotyp av den sjukdomsalstrande fortfarande oklara. Många mikrobiella arter har utvecklats för att överleva i stressiga miljöer genom självorganiserande i mycket organiserade fäst yta och matris inkapslade strukturer som kallas biofilm 2-4. Tillväxt i samhällen förefaller vara en föredragen överlevnadsstrategi av mikrober, som kan uppnås genom genetiska komponenter som reglerar ytvidhäftning, intercellulära kommunikationen, och syntes av extracellulära polymera substanser (EPS) 5,6. Toleransen av miljöbetingad stress är sannolikt underlättas av EPS, och kanske av physiologiska anpassning av individuella baciller till heterogena mikromiljöer inom komplex arkitektur av biofilmer 7.
I en serie nya dokument vi etablerat att M. tuberkulos och Mycobacterium smegmatis har en stark benägenhet att växa i organiserade flercelliga strukturer, som kallas biofilmer, vilket kan tolerera mer än 50 gånger de minimala inhibitoriska koncentrationen av anti-tuberkulos läkemedel isoniazid och rifampicin 8-10. M. tuberkulos, men fascinerande kräver särskilda förhållanden för att bilda mogna biofilm, särskilt 9:1-förhållande i headspace: media samt begränsat utbyte av luft med atmosfären 9. Kraven specialiserade miljöförhållanden kan eventuellt kopplas till det faktum att M. Tuberkulos är en obligat mänskligt patogen och har därmed anpassats till vävnad miljöer. I denna publikation visar vi metoder för odling M. tuberkulosbiofilmer i en flaska och en 12-brunnars platta format, vilket är bekvämt för bakteriologiska samt genetiska studier. Vi har beskrivits i protokollet för en försvagad stam av M. tuberkulos, mc 2 7000, med strykning i de två loci, panCD och RD1, som är avgörande för in vivo tillväxt av patogenen 9. Denna stam kan användas säkert i en BSL-2 inneslutning för att förstå grundläggande biologi tuberkulos patogenen därmed undvika kravet på en dyr BSL-3 anläggning. Metoden kan förlängas med lämplig modifiering i media, att växa biofilm av andra odlingsbara mykobakteriella arter.
Sammantaget kommer en enhetlig protokoll för odling mykobakteriella biofilmer hjälpa utredarna intresserade av att studera de grundläggande elastiska egenskaper mykobakterier. Dessutom kommer en klar och koncis metoden för växande mykobakteriella biofilmer bidrar också den kliniska och farmaceutiska investigators för att testa effektiviteten av ett potentiellt läkemedel.
Protocol
1. Växande biofilmer av M. tuberkulos i en 250 ml med skruvkork försedd flaska
- Medieberedning: Lös 0,5 g KH 2 PO 4, 0,5 g MgSO 4, 4 g L-asparagin, 2 g citronsyra, 0,05 g jämammoniumcitrat, 60 ml glycerol i 900 ml vatten. Justera pH till 7,0 med NaOH. Autoklav, cool och strax före start experimentet, tillsätt sterilt ZnSO 4 till en slutlig koncentration av 0,1% w / v. Eftersom mc 2 7000 är en pantotenat auxotrof denna stam kräver också pantotensyra på 10 M-g/ml den slutliga koncentration.
Obs: Detta är en standard sammansättning av Sautons media som används för M. tuberculosis. Emellertid, om så erfordras andra specialiserade medier kan också användas för andra mykobakteriella arter.
- Ympar förberedelser: Grow M. tuberkulos 7H9OADC med 0,05% Tween-80 under en vecka, eller OD 600 på 0,7 till 1,0. Culture kan direkt användas som inokulum vid en spädning av 1:100.
- Tillsätt 25 ml av Sautons media till en 250 ml skruv utjämnade polystyren flaska (Corning). Tillsätt 250 pl av inokulum till mediet, locket på flaskan mycket tätt och placeras ostörd i en befuktad 37 ° C inkubator under 3 veckor. Observera flaskan en gång varje dag för att säkerställa att det inte finns någon kontaminering.
- Vid slutet av tredje veckan, lossa locket på flaskan för att medge ytterligare tillväxt av M. tuberkulos vid gränsytan. Om locket inte lossas på detta stadium då den otillräckliga syrekoncentrationen i behållaren kommer att fördröja ytterligare tillväxt av bakterier.
2. Tillväxt av M. tuberculosis biofilmer i 12-brunnsplattor
- Förbered media och ympning av mc 2 7000 som beskrivs i avsnitt A1 och A2.
- Blanda 60 ml av media med 600μl av inokulat. Fördela 4,5 mL av blandningen i varje brunn i plattan. Täck plattan med locket. Linda plattan flera gånger med parafilm. Inkubera plattan ostörd i fuktad inkubator vid 37 ° C under 5 veckor.
3. Fastställande av frekvensen av narkotika toleranta persisters i M. tuberkulos biofilmer
- Odla M. tuberculosis biofilmer i en 12-såväl format som beskrivs i avsnitt B. Detta kommer att ta ett totalt cirka 5-veckor.
- När biofilmen är mogna (efter 5 veckors inkubation) injicera ditt val av antibiotika vid önskad koncentration i medierna under de biofilmen med en mikrospets i en pipett.
Obs: Volymen av media under de pellikler minskar till ca 3,0 ml. Så utredare bör därför beräkna mängden läkemedel.
- Snurra plattan försiktigt så att antibiotikan ordentligt sprids i mediet. För statistiskt signifikanta resultat, injicera antibiotiörat i fyra brunnar. Parallellt, injicera samma volym av lösningsmedel, i vilket den antibiotiska löstes i andra fyra brunnar, och lämnar de sista fyra brunnar i orörd plattan. Täck plattan med locket och lägg färska lager av parafilm runt plattan. Placera den tillbaka i inkubatorn för önskad tidsperiod.
- Vid slutet av inkubationen öppna plattan och tillsätt Tween-80 till den slutliga koncentrationen av 0,1% (volym / volym) i varje brunn. Snurra hela plattan försiktigt i jämn spridning av tvättmedlet. Inkubera plattan vid rumstemperatur under 15 minuter. Blanda innehållet i varje brunn med pipett flera gånger så att hela innehållet jämnt kan överföras till en 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera ner innehållet i röret vid 4000 rpm under 10 minuter vid rumstemperatur. Återsuspendera pelleten i 5 ml färskt tvättbuffert (PBS med 10% glycerol och 0,05% Tween-80). Upprepa tvätt tre gånger. Återsuspendera pelleten i 5 ml av tvättbuffert. Håll det på navigeringsknappen för overnight vid 4 ° C.
OBS: Även låg temperatur utvecklades ursprungligen för M. smegmatis (för att minimera sin tillväxt under dispersion) och används för M. tuberculosis också, kan de långsamt växande arter som är mest sannolikt att vaggas vid rumstemperatur utan någon inverkan på resultatet. Rocking vid rumstemperatur kan vara nödvändig om att arbeta i BSL-3 anläggning.
- Förbered en steril spruta försedd med mikrospets (2-200 ^) genom att skära sitt breda änden till lämplig storlek, passar den till sprutan och linda den med parafilm. Passera hela innehållet i röret genom spets-monterade spruta och samla upp i en färsk 15 ml rör. Upprepa detta steg 5 till 6 gånger tills du observerar en ganska homogen suspension.
- Förbered seriella utspädningar av suspensionen och plattan de utspädningar för 7H11OADC plattan för att bestämma antalet livsdugliga kolonier i varje brunn. Inkubera plattorna under tre veckor i 37 ° C inkubator. Bestämma frekcy av persisters i biofilmen populationen genom att beräkna kvoten av antalet kolonier som erhölls i antibiotikum behandlades med de som erhölls på lösningsmedel behandlade plattor.
4. Representativa resultat
När de odlas i en flaska, tillväxt av M. tuberkulos kan ses vid basen av flaskan vid slutet av den första veckan. Vid slutet av den andra veckan, kan fläckvis tillväxt av bakterier på luft-media interface ses, även om tillväxten i luften-media gränssnittet är konsekvent syns i slutet av den tredje veckan (Fig. 1A). Vid denna tidpunkt fastsättningen av bakterierna till väggen av behållaren har också observerats. Från denna punkt och framåt tillväxt av kulturen sker i första hand på luft-media gränssnitt. Vätskan under ytan tillväxt är uppenbar. Typiskt mognar strukturen vid slutet av den femte veckan (Fig. 1 B). Om inkubationen är förlängd, kommer strukturerna att börja sjunka till botten av behållaren. Intressantåtdragning av den gemensamma jordbrukspolitiken fram till slutet av tredje veckan är ett viktigt steg i processen, och av okänd anledning ett löst försluten flaska betydligt fördröjer initiering av tillväxt på gränssnittet 9.
I 12-brunnsformatet, är en kraftfull biofilmen på luft-mediumgränssnittet ses i var och en av brunnarna i slutet av fem veckor (fig. 2A). Om plattorna inte lindade helt sedan differential biofilm tillväxt observeras. I värsta fall kan signifikant medier indunstning överstegra tillväxten av bakterier (fig. 2B). Således, inslagning av plattan är nödvändig både för att förhindra att avdunstning samt att ge förutsättningar för biofilm bildning (se föregående punkt).
Antalet livsdugliga bakterier i biofilmer bestämda med denna teknik är tämligen reproducerbar. Svaret hos M. tuberkulos biofilmer varierar med den typ av antibiotika. För ett bakteriedödande antibiotika som rifampicin, följer förlust av livskraft ett bipha sic trend 9. En snabb minskning av viabiliteten under de första tre till fyra dagar, följt av en ihållande fas i vilken en liten andel av befolkningen förbli helt motsträviga mot antibiotika oberoende av koncentrationen av antibiotikumet, tiden för exponering. Figur 3 visar antalet livsdugliga bakterier i mogna biofilmer efter en 7-dagars exponering för 50 pg (50 gånger högre än MIC) av rifampicin.
Figur 1A. Tidig utseende M. tuberkulosbaciller på luft-media interface av bakterier efter 3 veckors inkubation.
Figur 1B. Lagrad biofilmer av M. tuberkulos på luft-media interface efter fem veckors inkubation.
820/3820fig2A.jpg "/>
Figur 2A. 5-veckor gamla biofilmer av M. tuberkulos odlas i 12-brunnsformat.
Figur 2B. Ett misslyckat försök att odla M. tuberculosis biofilmer i 12-brunnar utan parafilm.
Figur 3. En representativ kurva som visar frekvensen av läkemedelspartiklar toleranta persisters i M. tuberkulos biofilmer odlas i 12-väl format och utsatt för 50 pg av rifampicin under sju dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tuberkulos (tbc), orsakad av infektion av Mycobacterium tuberculosis, är fortfarande ett stort hot mot den globala folkhälsan. Nästan en tredjedel av världens befolkning beräknas vara asymptotiskt smittas av patogenen, cirka 9 miljoner nya fall dyker upp i kliniken varje år med symtom på aktiv tuberkulos och ungefär 1,7 miljoner dör av infektionen varje år 11. Den stora bördan av sjukdomen i första hand bidragit med brist på vaccin och en mycket komplicerad kemoterapi som innebär en multiresistent regim administreras under sex till nio månader. Den förlängda kemoterapi beror i hög utsträckning fenotypisk tolerans av en liten subpopulation av den patogen som erfordras förlängd exponering av antibiotika 12. Även inrikta sig på dessa persisters är avgörande för kort och effektiv behandling av tuberkulos, mekanismerna bakom utvecklingen av dessa persisters fortfarande oklara.
Mest mikrobiell species i sin naturliga livsmiljö spontant växer i sig själv monterade, kallad ytvatten bifogade flercelliga samhällen biofilmer, som är mycket toleranta mot antibiotika 3. Nyligen har det visats att flera mykobakteriella arter, har en stark benägenhet att växa in vitro enligt biofilmer, som ger en mikromiljö som främjar utvecklingen av läkemedelsresistenta toleranta persisters 9,13-15. Medan snabbt växande miljöproblem arter som M. smegmatis kan lätt bilda biofilm i tvättmedel-fria media, långsamt växande patogena arter M. tuberkulos kräver särskilda villkor för att bilda flercelliga strukturer 9. Eftersom odling M. tuberkulos hos biofilmer skulle kunna få insikt i de mekanismer av läkemedel tolerans och uthållighet, spridning av ett detaljerat protokoll för odling av patogenen i biofilmer genom en öppen källkod kommer att vara värdefull för tuberkulos forskning, i synnerhet i en resurs-begränsad country.
Här beskriver vi den metod att växa M. tuberkulos i biofilmer i detalj. Vi erbjuder också ett protokoll för att bryta biofilmer och bestämma antalet livsdugliga baciller i befolkningen. Denna teknik kan användas för att bestämma antalet läkemedel toleranta persisters i kulturen. De tre mest kritiska stegen i odling biofilmer är: 1) val av en lämplig detergent-fria medier, stängt kulturen container under första tre veckorna, och öppna behållare för efterföljande inkubation. Vidare håller behållaren i en befuktad tillstånd är också kritisk för att förhindra avdunstning av medium under 5-veckors inkubering. Detta kan avsevärt försvåra reproducerbarhet av resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Arbetet har utförts med ekonomiskt stöd från National Institute of Health och American Lung Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-well tissue culture plate | VWR international | 62406-165 | |
| 50-mL conical tubes | VWR international | 89039-660 | |
| Rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Chromatographic refrigerator | VWR international | 55702-520 | |
| petri dish | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 | |
| 12 well plates | Falcon BD | 353043 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| methanol | JT Baker | 9070-05 | |
| 10mlLsyringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 1-200μL pipet tips | VWR international | 89079-458 | |
| parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
References
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
