ى Moxi مصغر عداد خلية الآلي أداة الرواية التي تجمع بين مبدأ كولتر مع براءة اختراع تكنولوجيا الاستشعار الأغشية الرقيقة وخوارزمية البرمجيات الاحتكارية لأداء التحجيم والفرز من طائفة واسعة من حجم الجزيئات، وكذلك لتحديد الصحة العامة للmonodisperse الثقافات خلايا الثدييات. هذا البروتوكول ويصف استخدام هذه الأداة لحساب وتقييم الصحة للثقافات الخلية.
Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for “coincidence events” in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 – 25 microns (dynamic range 2 – 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 – 20 microns (dynamic range 2 – 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 – 8,180 fL and the 3 – 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 – 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a “Cell Sensing Zone” (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.
تنفيذ الكامنة لا يمكن للنهج كولتر تكون حتمية وقابلة للدقة العامة للقياسات. وثمة مجال حاسم هو تصحيح لعدد الخلايا الخام "لأحداث من قبيل المصادفة" حيث اثنين أو أكثر من الخلايا في وقت واحد يمر من خلال فتحة ويتم قياسها كما حدث كهربائي واحد. "أحداث الصدفة" المساهمة في الخطأ والتي تختلف تبعا لعدد من العوامل بما في ذلك حجم الخلية ودرجة التجميع (ديفيس وآخرون 1967) 6. ونتيجة لذلك، لا يمكن للمصادفة المطلوبة لتصحيح أي عينة محددة يمكن التنبؤ بها، متفاوتة على نطاق واسع بين خلية / الجسيمات أنواع وحتى بين الثقافات المختلفة من أنواع الخلايا متطابقة. أنشأ نظرية، متجذرة في المنشورات الأولية التي كولتر، ينطوي على تطبيق تسوية لوغاريتمي من التهم الخام استنادا إلى عدد من الفعاليات لوحظ وتجريبيا والمحددة، عامل تصحيح الجسيمات محددة، ض. بينما يمكن تعداد دقيق يتحقق بشكل صحيح مع تيخوارزمية تصحيح له، هي محدودة في تطبيقه العملي نظرا لاختلافات كبيرة في القيم ض بين أنواع الخلايا، وصعوبة التنبؤ بدقة المقابلة في قيمته. هنا، وذلك باستخدام "الحقيقي" عدد الخلايا التي حددتها منحنى Moxi المناسب Z بالتزامن مع مصادفة خوارزمية تصحيح، وZ Moxi بتصحيح حيوي للصدفة لتحقيق تركيزات صحيح. أنتجت Z Moxi بالمقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام الراقية كولتر Z2، تهم مماثلة عبر مجموعة من تركيز 0 – 500000 خلية / مل (نوع M كاسيت) و 3،000 – 2-2.5e 6 خلية / مل (كاسيت نوع S) . علاوة على ذلك، Z Moxi يحقق هذا العدد مع دقة معامل منخفض مماثل من التباين في التهم والدقة في التحجيم الجسيمات التي هي سمة من معيار الذهب، كولتر، في أسلوب العد الخلية.
وعلاوة على ذلك، فإن البيانات المقدمة هنا تشير إلى أن Z Moxi يمكن أن توفر معلومات قيمةفيما يتعلق الصحة العامة للمزارع الخلايا. ى Moxi تعزز النهج منحنى المناسب مع خوارزمية البرمجيات الاحتكارية لتحديد هذا التقييم الصحة الثقافة. تغيرات شكلية المرتبطة موت الخلايا، مثل blebbing، تفكك، والتشوهات الحجمية (Kataoka وTsuruo 1996، Liegler وآخرون 1995، وشيريدان وآخرون 1981) 12-14، وجعل من الممكن للMoxi-Z لتمييز الفروق بين impedimetric ويعيش السكان والقتلى من السكان خلية / الحطام. يتم إنشاء MVI من خلال تحليل توزيع حجم ثقافة / جسيم لتحديد المساهمات النسبية للجسيمات الحطام، وخلايا نخرية منكمشة، ومنحنى المجهزة سكان الخلية من الفائدة. قيمة MVI يعكس بذلك مؤشر عدد السكان أو تدبير ratiometric من تعداد السكان monodisperse فيما يتعلق الشخصي الجسيمات إجمالي عدد السكان. هذه القيمة ثم حسابيا، تعديل الإحصاءات السكانية والملاحظات التجريبية. Becausه في MVI ينظر غيرها من المعالم من النهج تلطيخ التقليدية، وليس من المتوقع أن تعكس هذه التقنيات ولكنها توفر بدلا من وجهة نظر بديلة قيمة حول صحة ثقافة الخلية، وخاصة فيما يتعلق الحطام والملوثات الميكروبية.
وباختصار، فإن خلية مكافحة Moxi-Z هو متطرف صك الفوق الصغيرة التي توفر دقة والمقايسات استنساخه من عدد الخلايا، حجم الخلية، والصحة الخلية باستخدام مبدأ كولتر وخوارزميات البرمجيات منحنى تركيب جنبا إلى جنب مع التكنولوجيا على براءة اختراع جهاز استشعار الأغشية الرقيقة . مع نوع كاسيت M فهي قادرة على فرز جزيئات تتراوح 4-25 ميكرون في القطر (مجموعة ديناميكية من 2 – 34 ميكرون)، في 8 ثوان. مع كاسيت نوع S فهي قادرة على فرز جزيئات تتراوح بين 3 – 20 ميكرون في القطر (مجموعة ديناميكية من 2-26 ميكرون)، في 15 ثانية. علاوة على ذلك، Moxi-Z يؤدي التقييمات الصحية من دون استخدام الكواشف. انها اقل بكثير الأسواق العالمية ضغطها العملnsive والذاتية من الفرز اليدوي. بالمقارنة مع العد كولتر القياسية، وMoxi هو أسرع وأصغر بكثير، وتوفر المزيد من المعلومات، تتطلب صيانة أقل بكثير، من الأسهل للاستخدام، وجزء بسيط من التكلفة.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ORFLO Diluent | ORFLO | MXA006 | |
Cassette Dispenser | ORFLO | Stores up to 25 cassettes for convenient dispensing | |
USB Cable | ORFLO | Connects instrument to PC/Mac or power adapter | |
Power Adapter (US and EU models only) | ORFLO | Connects USB cable to an AC outlet | |
USB Flash Drive | ORFLO | Stores Moxi Z software and user manual | |
Calibration Check Beads | ORFLO | ||
Electronic Calibration Cassette | ORFLO | Electronic cassette for verifying proper system operation and calibration |