Summary
Moxi Z 초소형 자동 세포 계수기는 특허 박막 센서 기술과 사이징을 수행하는 독점적인 소프트웨어 알고리즘과 입자의 넓은 크기의 범위를 계산뿐만 아니라 monodisperse의 전반적인 건강을 결정하는 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 원리를 결합한 소설 악기 포유 동물 세포 배양. 이 프로토콜은 세포 배양의 건강을 계산하고 평가하는이 악기의 사용을 설명합니다.
Protocol
1. 샘플의 준비
- 세포 농도가 악기 (3,000 500,000 세포 / ML 타입 M 카세트를위한, 또는 3,000 2,500,000 세포 / 타입 S 카세트에 대한 ML)의 작동 범위 내에 있도록 ORFLO 희석제 또는 적절한 희석제와 세포 현탁액을 희석.
- 1시 20분 (타입 M 카세트) 또는 1시 5분 희석 (타입 S 카세트)에 노 희석에 1시 5분의 희석은 대부분의 포유 동물 세포 라인에 권장되지만 적절한 희석은 세포 종류와 심는 밀도에 따라 달라집니다. 정확한 숫자는 필요한 볼륨은 약 75 μL입니다.
2. 실행 샘플
- 전원 버튼을 누르고 홈 화면이 표시됩니다에 의해에 Moxi Z를 돌립니다.
- 트레이를 아래로 눌러 Moxi Z, 피펫 75μL 샘플이 ... 화면이 표시됩니다에 카세트를 삽입합니다.
- 카세트의 채움 포트 (파란색 타원형에 75 μL 시료를 피펫어느 카세트 끝에 따라 1 또는 2, 레이블) 악기에 삽입되었다. 이들은 2 시험에 사용할 수있는 일회용 카세트입니다. 참고 : 장소 끝이 잘 전면 입술 아래 잡은되도록 ~ 45 ° 각도로 잘 직접로드에 피펫 팁. 분배하면 카세트를 입력하도록 공기의 주머니를 일으킬 수로 진공이 유체의 분배에 대해 "출세"하지 않는 것이 중요합니다. 그것은 분배하는 동안 잘 넘는 액체 형태의 작은 구슬 (물론 항목의 크기)를 가지고하는 것이 좋습니다.
- 대부분의 포유 동물 세포를 카운트 들어, 시작하는 데 어디서나 화면을 만지지. 매우 작은 입자 (4-8 μm의 유형 M 및 3-8 μm의 타입 S의 평균 직경의 평균 직경)를 카운트 들어, Moxi Z는 작은 입자 모드에서 실행할 수 있습니다. 참고 : 카세트 타입은 화면 상단의 검은색 막대에 표시됩니다. 이 모드에서는 Moxi Z는 기본값으로 2-10 μm의 직경에 규모를 설정하고 카운트 u를 수행작은 세포 검출을위한 최적화된 매개 변수를 노래. 여기 터치 테스트를 시작하고이 모드에서 실행하도록 소형 입자 모드 버튼 (블랙 스퀘어) 누르십시오.
- Moxi Z는 테스트를 시작하며 세포 개수 결과는 약 8 초 (타입 M 카세트) 또는 15 초 (타입 S 카세트)에 완료됩니다.
- 곡선 피팅 및 MVI 계산이 자동으로 시작하고 몇 초 추가로 필요합니다. 적당한 발작이 발견되면, 결과는 자동으로 화면에 표시됩니다.
- 게이팅 기본 수집 모드를 확인하려면 곡선이 게이팅 모드로 전환하려면 카운트 버튼을 맞추기 누르십시오.
- 이때 카세트 장치에서 제거할 수 있습니다.
3. 관리 데이터
- AutoMode 스케일링이 꺼져있는 경우, 결과는 초기 곡선 맞춤 2-34 μm의 직경의 규모 (유형 M 카세트)를받을 2-26 μ에 대해 표시됩니다M (타입 S 카세트). Automode 스케일링가 켜져있다면, Moxi Z는 자동으로 모든 곡선 맞춤 데이터가 표시됩니다 확보하면서 곡선 맞춤 인구의 넓이에 가장 가까운 범위로 가로 축 (X 축)를 확장할 것입니다.
- AutoMode 스케일링 수동으로 높은 해상도에서 결과를 표시, 해제면, 2-26 μm의 아이콘 (M 타입) 또는 2-18 μm의 아이콘 (타입 S)를 만져. 참고 : 카세트 타입은 화면의 왼쪽 상단에있는 파란색 상자에 표시됩니다. 커브 - 피팅 기능뿐만 아니라 시각적으로 데이터의 미묘한 차이를 구별하는 사용자의 능력을 모두 향상시킬 수있는 작은 세포 또는 입자를 계수 때 권장합니다.
- 수평 해상도를 증가시 확장 버튼을 동적으로 사용할 수있는 X 축 스케일 범위 사이의 사이클링을 할 수 있도록 조정합니다 : 2-34, 2-26, 2-18 및 종류 M 카세트를위한 2-10 μm의, 또는 2 타입 S 카세트에 대한 -26, 2-18 및 2-10 μm의. 이 기능은 availa입니다즉시 셀 카운트를 따라 경.
- 곡선 맞춤 또는 게이트디 지역 카운트 정보 (세포 / ml) 쇼핑은 히스토그램의 왼쪽 아래에 블랙 박스에 표시됩니다. 평균 셀 크기 정보는 히스토그램의 오른쪽 아래에 블랙 박스에 표시됩니다.
- MVI 값이 히스토그램의 오른쪽 상단에 파란색 상자가 표시됩니다. 검사는 작은 입자 모드에서 실행 되었다면 MVI이 적용되지 않고 "MVI = SPM"로 표시됩니다. 세포의 농도가 MVI 운영 범위, "범위 MVI = 부족"의 메시지 이외의 경우 또한 표시됩니다.
- 현재 히스토그램을 저장하려면 완료 아이콘을 만질. 이것은 XXX는 해당 시험 번호입니다 "테스트 XXX"의 이름으로 데이터를 저장합니다.
- 수동으로 게이트 히스토그램을 위해, 곡선 맞추기 카운트 결과 버튼을 켜고 만질. 이것은 게이팅 기본 수집 모드를 만듭니다. 다음 회를 성문을 설정하거나 생략하고 각 파란색 게이팅 마커 밀어미세 게이트 조정을위한 e 왼쪽 및 오른쪽 화살표 (이들은 파란 게이팅 마커를 감동시 표시)은 마커 사이에있는 세포가 포함됩니다. 히스토그램 수직 스케일은 자동으로 곡선 맞춤 인구 진폭을 기반으로 확장됩니다. 이 수직 스케일을 조정하려면 히스토그램 영역에서 슬쩍가 화면 위나 아래로.
- 곡선 맞춤 모드로 디스플레이를 반환하고 곡선 맞춤 모드는 기본 수집 모드를 만들기 위해 게이트 카운트 결과 단추를 만져.
- 그런 다음 결과를 저장하고 홈 화면으로 돌아갑니다 완료 아이콘을 누르십시오. 결과를 삭제하려면 영구적으로 시험 결과를 삭제하려면 언제든지 삭제 아이콘을 누르십시오.
4. 이전 획득 데이터의 분석
- 저장된 테스트를 열려면 홈 화면의 히스토그램 아이콘을 누르십시오.
- 최대 9 저장된 histograms에 대한 아이콘이 화면에 표시됩니다.관심 시험에 적절한 아이콘을 누르거나 더 많은 테스트 결과를 볼 수있는 아이콘이 아래 페이지 위로 또는 페이지를 누르십시오.
- 각각의 히스토그램은 그것이 구원받은 방법에 따라 곡선 맞추기 카운트 모드 또는 게이트 카운트 모드 중 하나에서 열립니다. 게이트 카운트 모드에서 게이팅 마커는 독립적으로 각각 블루 게이팅 마커를 밀어서 원하는대로 배치 할 수 있습니다. 자동 게이트는 원하는 정상에 감동하여. 게이트 카운트와 곡선 맞추기 카운트 모드를 토글 만져.
- 히스토그램의 수직 스케일을 조정하기 위해 줌과 Unzoom 아이콘을 누르십시오. 수직 스케일은 또한 수직으로 아래로 표시 최대 (증가) 또는 (감소)에 손가락을 보내주시면하여 변경할 수 있습니다.
- 영구적으로 시험 결과를 삭제하려면 삭제 아이콘을 누르십시오.
- 에 완료 아이콘을 누르면테스트 결과를 닫고 홈 화면으로 돌아갑니다. (참고 : 확대된보기가 저장되지 않습니다.)
5. PC로 데이터를 전송
- 데이터는 PC 또는 Mac에 Moxi Z USB 케이블을 연결해하여 Orflo의 Moxichart 응용 프로그램을 사용하여 PC로 또는 USB 전송을 통해 전송할 수 있습니다. 블루투스 전송의 경우 (MoxiChart) 먼저 Moxi Z 단위의 홈 화면에 블루투스 아이콘을 눌러 장치의 블루투스 ID를 결정합니다.
- 컴퓨터에서 MoxiChart 응용 프로그램을 열고 오른쪽 상단에있는 블루투스 아이콘을 클릭하십시오. 다음 Moxi Z의 블루투스 아이디에 해당하는 장치를 선택하고 업로드된 파일에 대한 대상 폴더를 선택합니다.
- Moxichart이 자동으로 블루투스 연결을 통해 지정된 디렉토리에 모든 파일을 전송합니다.
- 블루투스 (MoxiChart) 또는 USB로 전송된 파일은 analy 열리고 수그들은 포맷되기 때문에, MoxiChart 응용 프로그램과 함께 직접 제드 자형의 것 또는. csv 파일은, 그들은 직접 추가 / 사용자 정의 분석을 위해 Microsoft Excel 또는 다른 데이터 분석 프로그램에서 열 수 있습니다.
6. 대표 결과
Moxi Z의 정밀도 및 정확도를 평가하려면, HEK-293 세포, HELA 세포, CHO-K1, 효모, Jurkat E6-1 세포, PC12 세포 및 건의는 0-500,000 세포에서부터 농도와 비드 현탁액을 정밀 보정 / ML (타입 M 카세트)과 0-2-2.5e 6 셀 / ML (타입 S 카세트)을 계산하고 모든 포유 동물 세포를 미국 유형 문화 수집 (ATCC)에서 얻은되었다 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 Z2와 Moxi Z '를 사용하여 비교했다 그리고 교양 등 이전에 7-11을 설명했다. 간단히, 세포는 RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HELA) 셀 또는 F12K (CHO-K1) 전지의 핵심 매체와 75mm 두 조직 문화 flasks에 정지에서 배양해되었다. 모든 미디어로 보충되었다10% 태아 소 혈청과 100 U penicillin/100 μg의 스트렙토 마이신. Flasks는 5퍼센트 CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터 유지되었다. 세포는 삼일마다 passaged되었다. 효모 세포는 (X5, C. albicans, 빈 13) 기증과 즉시 같이 제공된 사용되었습니다. 타입 M 카세트 데이터와 타입 S 카세트에 대한 ~ 2 2.5e 6 셀 / ML위한 ~ 500,000 세포 / ML의 초기 샘플의 농도는 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 Z2를 사용하여 설립되었다. 후속 이론 농도 수준은 생리적 버퍼 (Isoton II 또는 행크의 균형 식염수)와 시리얼 dilutions을 통해 준비했습니다. 각각의 농도에서 동일한 샘플은 두 시스템에 의해 측정되었으며 서로 역모를 꾸몄다. 그림 2에서 볼, 강한 선형 상관 관계가 있었다 (타입 M R 2> 0.9886, 유형 S R 2> 0.9781) 모든 샘플에 대한 카운트 사이. 농도는 또한 Moxi Z와 Z2 모두와 이론 / 예상 세포 농도와 비교되었다 (
정밀도를 평가하려면, HEK-293 및 HELA 세포 카운트는 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 Z2, Moxi Z 및 hemocytometer를 사용하여 수행되었다. 이력서는 200,000-300,000 셀 / ML 범위 5 별도 카운트에서 측정한 것으로 Moxi Z (타입 M 카세트), 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 Z2과 hemocytometer를 사용하여 셀 카운트의 편차의 평균 계수는 (이력서, N = 19) 계산되었다. Moxi Z의 작은 평균 이력서 (그림 4) Z2의 비교 및 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 기반의 계산 기술에서만 달성 가능한 정밀도의 높은 수준의 대표이다.
Moxi Z 악기의 치수 정밀도는 구입, 정밀 보정 폴리스티렌 구슬의 측정을 통해 다음 평가되었다. Moxi Z에서 평균 입자 크기 측정 (n은 = 5)를 제조보고 크기가 역모를 꾸몄다되었다. 볼 수 있듯이 전N 그림 5는 Moxi Z 측정은 지속적으로 높은 선형 상관 관계 (R 2 = 0.9989)와 제조 업체 값을 일치.
크기와 카운트 정보 이외에도, Moxi Z는보고 Moxi의 생존 능력 지수 (MVI) 값을 가진 포유 동물 세포 배양 건강 시약이없는, 일반적인 평가를 제공합니다. 이 인덱스는 전체 미립자 카운트와 관련하여 관심 인구 세포의 수를 비율로 생성됩니다. MVI 측정 기능을 발휘하려면, MVI의 판독 (타입 M 카세트)가 표준 설명서 및 흐름 cytometric 죽은 / 실시간 측정 기법을 비교했다. 죽음 (<10% 가능한) HEK-293과 HELA 세포의 인구는 37 희석제 (Isoton II, Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날)을 포함한 영양소 프리, 나트륨 불화물 ° C로 살아있는 세포의 하룻밤 incubations을 통해 만들어진 제어 이론 생존 수준은 살아있는 죽은 세포의 ratiometrically 혼합 알려진 농도에 의해 준비되었다. 해상도ulting 솔루션은 hemocytometer 카운트 및 유동 cytometer 측정 모두에서 중복의 생존 능력 수준에 대해 분석했다. Hemocytometer 측정은 0.1 % Trypan 블루 솔루션 및 세포 전통 50분의 50 혼합되어 사용되었다. 유동세포계측법 측정은 Viacount 시약 및 제조 지정된 프로토콜 (머크)를 사용 구아바 PCA cytometer (머크)를 사용되었다. 마찬가지로 그림 6과 같이 HEK 세포와 HELA 세포 "에 대한 유사 hemocytometer의 생존 비율로 MVI 데이터의 선형 적합의"피어슨 상관 계수 값 (R 2) = 0.9937 및 R 2 = 0.9728, 각각 R이 있었다. 이러한 결과는이 접근법은 유동 cytometer 또는 hemocytometer를 사용하여 얻은 라이브 / 죽은 측정에 유리하게 비교할 세포 viabilities 광범 걸쳐 문화 건강 정보를 제공하는 것을 보여줍니다.
표 및 그림 (Dittami 외 2011에서.) 15 :
1 그림. 박막 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날의 계산 : 전기 전류는 박막 카세트의 셀 감지 구역을 통해 전달됩니다. 세포 CSZ를 통해 하나의 파일을 흘러로서, 전압의 순간적인 증가는 Moxi Z '로 측정된다
그림 2. Moxi Z 카운트는 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 Z2 카운트 비교할 수 있습니다. 세포 및 비드 현탁액의 동일한 카운트가 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 Z2와 Moxi Z '를 사용하여 계산되었다해도 Moxi Z 카운트의 카운트 값 (N = 3-4)를 평균에 대하여 꾸몄다되었습니다 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 해당 Z2 건의 및 선형 끼워 맞춤 R 2 값이 결정됩니다. ) 종류 M 카세트 - 0의 농도 범위 - 500,000 셀 / ML. B) 타입 S 카세트 - 0의 농도 범위 - 2-2.5e 6 / ml.Error 바에 따르면 ± 1 표준 편차.
그림 3. Moxi Z 농도 측정은 이론적으로 세포 농도를 VS. ) 종류 M 카세트 - 이론 농도 값은 초기 500,000 세포 / ML 시료의 시리얼 dilutions에서 준비가되어있다 B) 타입 S 카세트 -. 2.5e 6 셀 / ML 시료 - 이론 농도 값은 초기 2의 시리얼 dilutions에서 준비되었다. 오류 바 ± 1 표준 편차를 나타냅니다.
4 그림. 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 Z2, Moxi Z (타입 M 카세트) 및 Hemocytometer위한 변동 계수는. 각 접근 방식 HEK-293 및 HELA 세포 카운트의 편차의 평균 계수는 (이력서, N = 19) 별도 5에서 측정한 CVS로 계산되었다 300,000 셀 / ML 범위 - 200,000의 HEK-293과 HELA 셀 건의. 오류 바 ± 1 표준 편차를 나타냅니다.
그림 5. Moxi Z-Moxi Z를 사용하여 입자 크기 측정의 정밀도는 구슬 크기를 측정 (타입 M 카세트) 대 제조 업체 비드 크기를보고했다. 오류 바 ± 1 표준 편차를 나타냅니다.
6 그림. MVI를 사용하여 문화 건강 평가 - hemocytometer를 사용하여 시각적, trypan-푸른 스테인드 생존 카운트 대 MVI 측정 (타입 M 카세트)와 구아바 PCA Viacount의 생존 능력의 비교.
Discussion
기본 구현은 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날의 접근 방식은 측정의 전반적인 정확도 높은 결정적이 될 수 있습니다. 임계 영역은 둘 이상의 세포가 동시에 조리개를 통과하고 한 전기 사건으로 측정되는 "우연 사건"에 대한 원시 세포 카운트의 수정입니다. "우연 사건"은 세포 크기와 클러스터링의 정도 (데이비스 외 1967) 6를 포함한 여러 가지 요인에 따라 달라집니다 오류에 기여한다. 그 결과, 주어진 샘플에 대한 필수 우연 보정 널리 셀 / 입자 타입 간의 심지어는 동일한 세포 유형의 서로 다른 문화 사이의 변화, 예측 할 수 없습니다. 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날에 의해 초기 출판물에 뿌리 이론을 설립 관찰 행사와 경험적으로 정해진, 입자 고유의 보정 계수, Z의 숫자에 따라 원료 카운트의 대수 조정을 적용하는 것입니다. 정확한 카운트가 제대로 t 스위치와 함께 얻을 수 있지만그의 보정 알고리즘은, 그것은 세포 종류와 정확히 그 값을 예측에 대응하는 어려움 사이의 Z 값의 큰 변화로 인해 그 실질적인 적용에 제한됩니다. 여기서 우연 보정 알고리즘과 함께 Moxi Z 커브 피팅으로 식별 '참'셀 카운트를 사용하여 Moxi Z는 동적으로 진정한 농도를 달성하기위한 우연의 일치를 위해 해결합니다. 500,000 세포 / ML (타입 M 카세트)와 3,000 - - 2-2.5e 6 셀 / ML (타입 S 카세트) 하이 엔드 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 Z2를 사용하여 얻은 결과를 비교하면, Moxi Z는 0의 농도 범위에 걸쳐 비교 카운트를 생산 . 또한 Moxi Z는 카운트에서 변화의 유사한 낮은 계수와 황금 표준 세포 계수의 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 - 기법의 특징은 입자 사이징의 정밀도로이 카운트 정확성을 실현.
또한, 여기에 제시된 데이터는 Moxi Z '가 유용한 정보를 제공할 수 있음을 나타냅니다셀 문화의 전반적인 건강에 관한. Moxi Z는이 문화 건강 평가를 결정하는 독점적인 소프트웨어 알고리즘과 커브 피팅 접근 방식을 활용합니다. 분리 파괴 등 blebbing 같은 세포 죽음과 관련된 형태학의 변화, 그리고 용적 왜곡 (카타 오카와 Tsuruo 1996, Liegler 외 1995, 쉐리 던 외 1981) 12-14 불가능하게 Moxi-Z '가 사이 impedimetric 차이를 구별하기 위해 만들어 인구 및 죽은 세포 / 파편 인구를 살고 있습니다. MVI는 입자 파편의 상대적인 기여도, 수축된 괴사성 세포, 그리고 관심있는 커브-장착되어 세포 인구를 식별할 수 있도록 문화 / 입자 크기 분포를 분석하여 생성됩니다. MVI 값은함으로써 전반적인 입자 인구 프로파일에 관하여 monodisperse 인구 카운트 인구 지수 또는 ratiometric 법안을 반영합니다. 이 값은 다음 algorithmically - 조정 기반의 인구 통계 및 경험적 관찰이다. Becaus전자 MVI 전통 염색법 접근 방식이 아닌 다른 매개 변수를 바라보고, 그것은 이러한 기술을 반영할 것으로 예상되지 않는 대신 세포 배양의 건강에 중요한 대안보기는 특히 파편과 미생물 오염 물질과 관련하여 제공합니다.
요약에서는 Moxi-Z 셀 카운터는 특허 박막 센서 기술과 결합 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 원리와 커브 - 피팅 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 정밀 재현성 셀 개수의 assays, 셀 크기, 셀 건강을 제공하는 울트라 소형 benchtop 악기입니다 . 8초에 - 직경 25 미크론 (34 미크론 2의 다이나믹 레인지 -) 종류 M 카세트와 함께 4에서부터 입자를 계산이 가능합니다. 15 초 안에 - 직경 20 미크론 (26 미크론 2의 다이나믹 레인지 -) 유형 S 카세트와 함께 3에서부터 입자를 계산이 가능합니다. 또한, Moxi-Z는 시약의 사용없이 건강 평가를 수행합니다. 그것은 훨씬 더 적은 노동 inte입니다nsive 및 수동 계산보다는 주관적. 표준 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날의 계수에 비해, Moxi가 훨씬 작습 빠르고, 더 많은 정보를 제공 상당히 적은 유지 보수가 필요, 사용하기 쉽게, 그리고 비용의 분수입니다.
Disclosures
그레고리 M. Dittami 그분 Ayliffe는 Orflo 기술, 설계, 제조 및 판매 Moxi Z, 리처드 D. Rabbitt이 Orflo 테크놀러지에게 지급 컨설팅 전문, 아르바이트를 제공하는 회사의 직원입니다.
이 문서에 대한 생산 및 무료 액세스가 Orflo 테크놀로지의 후원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ORFLO Diluent |  ORFLO |
MXA006 | |
| Cassette Dispenser | ORFLO | Stores up to 25 cassettes for convenient dispensing | |
| USB Cable | ORFLO | Connects instrument to PC/Mac or power adapter | |
| Power Adapter (US and EU models only) | ORFLO | Connects USB cable to an AC outlet | |
| USB Flash Drive | ORFLO | Stores Moxi Z software and user manual | |
| Calibration Check Beads | ORFLO | ||
| Electronic Calibration Cassette | ORFLO |
Electronic cassette for verifying proper system operation and calibration |
References
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