Bestemmelse av pattedyrcelle Tellinger, Cellestørrelse og Cell tilstand ved hjelp av Moxi Z Mini Automatisert celleteller

Summary

Den Moxi Z miniatyr automatisert celleteller er en roman instrument som kombinerer Coulter prinsippet med patentert tynn-film sensor teknologi og en proprietær programvare algoritme for å utføre dimensjonering og telling av et bredt utvalg av størrelser av partikler, samt å bestemme den generelle helsen monodisperse mammalske cellekulturer. Denne protokollen beskriver bruken av dette instrumentet for telling og vurdere helsen til cellekulturer.

Abstract

Partikkel og celle telling brukes til en rekke applikasjoner, inkludert rutine cellekultur, hematologisk analyse, og industrielle kontroller ^1-5. En kritisk gjennombrudd i celle / partikkel telling teknologier var utviklingen av Coulter teknikken ved Wallace Coulter over 50 år siden. Teknikken innebærer bruk av et elektrisk felt over en mikron-størrelse blenderåpning og hydrodynamisk fokusering enkle partikler gjennom åpningen. Den resulterende okklusjon av blenderåpning ved partiklene gir en målbar endring i elektrisk impedans som kan direkte og presist korrelert celle størrelse / volum. Erkjennelsen av tilnærmingen som målestokk i celle / partikkel telling stammer fra den ekstraordinære presisjon og nøyaktighet av sin partikkel dimensjonering og teller, spesielt sammenlignet med manuelle og bildebehandling basert teknologi (nøyaktighet i størrelsesorden 98% for Coulter tellere versus 75 - 80% for manuelle og visjon-baserte systemer). Dettekan tilskrives det faktum at, i motsetning til bildebehandling-baserte tilnærminger til celle telling, gjør Coulter Technique en ekte tredimensjonale (3-D) måling av celler / partikler som dramatisk reduserer antallet forstyrrelser fra rusk og klynging ved å beregne nøyaktig volumetrisk informasjon om cellene / partikler. Samlet gir dette et middel for opplisting og dimensjonering celler i en mer nøyaktig, mindre kjedelig, mindre tidkrevende og mindre subjektiv måte enn andre telle teknikker ^6.

Til tross for prominence av Coulter teknikken i celle telling, har sin utbredt bruk i rutinemessige biologiske studier vært uoverkommelige grunn av kostnadene og størrelsen på tradisjonelle instrumenter. Selv om en rimeligere Coulter-baserte instrument har blitt produsert, det har begrensninger i forhold til sine dyrere motparter i korreksjon for "tilfeldighet hendelser" der to eller flere celler passerer gjennom åpningen og måles samtidig. Another begrensning med eksisterende Coulter teknologier er mangelen på beregninger på den generelle helsen celleprøver. Følgelig må flere teknikker ofte brukes i forbindelse med Coulter telle å vurdere celleviabilitet. Dette utvider eksperimentelle oppsett tid og kostnad siden de tradisjonelle metodene for levedyktigheten vurdering krever cellefarging og / eller bruk av kostbart og tungvint utstyr som en flowcytometer.

Den Moxi Z mini automatisert celleteller, som beskrives her, er en ekstremt liten Borstemmaskin instrument som kombinerer nøyaktigheten av Coulter prinsippet med en tynn-film sensor teknologi for å muliggjøre presis dimensjonering og telling av partikler fra 3-25 mikron, avhengig cellen telling kassetten brukes. Den M type kassett kan brukes til å telle partikler fra med gjennomsnittlig diameter på 4 - 25 mikron (Dynamic Range 2 - 34 mikron), og Type S kassetten kan brukes til å telle partikler med og gjennomsnittlig diameter på 3 - 20 mikrometer (dynamisk ringtee 2 - 26 mikron). Siden systemet bruker en volumetrisk målemetode, tilsvarer 4-25 micron til en celle volum rekke 34 - 8180 FL og 3 - 20 mikron tilsvarer en celle volum rekke 14-4200 fl, noe som er relevant når ikke-sfærisk partikler blir målt. For å utføre pattedyr celletall bruker Moxi Z, blir cellene som skal telles første fortynnes med ORFLO eller lignende væske. En celle telling kassett settes inn i instrumentet, og prøven er lastet inn i porten av kassetten. Tusenvis av celler er trukket, single-fil gjennom en "Cell Sensing Zone" (CSZ) i tynn-film hinne over 8-15 sekunder. Etter kjøringen, bruker instrumentet proprietære kurvetilpasning i forbindelse med en proprietær programvare algoritme for å gi en tilfeldighet arrangement korreksjon sammen med en vurdering av generelle kultur helse ved å bestemme forholdet mellom antall celler i befolkningen av interesse for det totale antallet partikler. De totale partikkel teller inklue krympet og brutt ned døde celler, samt annet rusk og forurensninger. Resultatene presenteres i histogram-format med en automatisk kurve, med porter som kan justeres manuelt etter behov.

Til syvende og sist gjør at Moxi Z telling med en presisjon og nøyaktighet sammenlignes med en Coulter Z2, dagens gullstandard, samtidig som det gir mer kultur helseinformasjon. Videre oppnår disse resultatene på kortere tid, med en mindre plass, med betydelig enklere drift og vedlikehold, og til en brøkdel av prisen av sammenlignbare teknologier.

Protocol

1. Utarbeidelse av prøver

1. Fortynn cellesuspensjonen med ORFLO fortynningsmiddel eller en passende væske, slik at cellen konsentrasjonen er innenfor driftsområdet av instrumentet (3000 til 500 000 celler / ml for Type M kassett eller 3000 til 2.500.000 celler / ml for Type S kassett).
2. En utvanning av 01:05 til 01:20 (Type M kassett) eller ingen fortynning til 1:5 fortynning (Type S kassett) anbefales for de fleste pattedyr cellelinjer, men den passende fortynning vil avhenge celletype og seeding tetthet. Volumet som kreves for en nøyaktig telling er ca 75 mL.

2. Running Prøver

1. Slå Moxi Z ved å trykke på strømknappen og startskjermbildet vises.
2. Trykk skuffen ned og sette inn en kassett inn i Moxi Z. pipetten 75μL Sample ... skjermen vises.
3. Pipettering en 75 mL prøve til fyllet porten av kassetten (blå ovalmerket 1 eller 2, avhengig av hvilken ende av kassetten ble satt inn i instrumentet). Dette er engangs-kassetter, som kan brukes for 2 tester. Merk: Sett pipettespissen direkte inn i lastingen brønnen på ~ 45 ° vinkel slik at spissen er fanget under fronten leppen av brønnen. Når utlevering, er det viktig at vakuum ikke "komme foran" av utlevering av væske som kan føre til lommer av luft inn i kassetten. Det anbefales å ha en liten perle (på størrelse med oppføringen godt) av væske form over brønnen under dispensering.
4. For å telle mest pattedyrceller, berør skjermen hvor som helst for å starte. For å telle svært små partikler (4 til 8 mikrometer gjennomsnittlig diameter for Type M og 3-8 mikrometer gjennomsnittlig diameter for Type S), kan Moxi Z kjøres i Small Particle Mode. Merk: kassetten indikeres i den svarte linjen øverst på skjermen. I denne modusen setter Moxi Z diameteren skala til 2 til 10 mikrometer som standard, og utfører tellingen usynge optimaliserte parametrene for påvisning av små celler. Trykk på TOUCH HER Small Particle Mode-knappen (svart firkant) for å starte testen og kjøre i denne modusen.
5. Den Moxi Z vil begynne testen og celletall resultatene vil være komplett i ca 8 sekunder (type M kassett) eller 15 sekunder (Type S kassett).
6. Den kurvetilpasning og MVI beregninger starte automatisk og krever bare noen ekstra sekunder. Når en egnet passform er funnet, vil resultatene da automatisk vises på skjermen.
7. For å gjøre Gating standard oppkjøpet modus, trykk Kurvetilpasning Count knappen for å veksle inn Gating modus.
8. På dette punktet kassetten kan fjernes fra enheten.

3. Administrere data

1. Hvis AUTOMODE skalering er av, er resultatene i utgangspunktet vises for en kurve regne med en diameter skala fra 2-34 mikrometer (Type M kassett) eller 2-26 μm (Type S kassett). Hvis AUTOMODE skalering er på, så Moxi Z automatisk skalere den horisontale aksen (x-aksen) til området som ligger nærmest bredden på kurvetilpasning befolkning og samtidig sikre alle kurvetilpasning data vises.
2. Hvis AUTOMODE skalering er av, for å manuelt vise resultatene på en høyere oppløsning, berører 2-26 mikrometer ikonet (Type M) eller 2-18 mikrometer ikonet (Type S). Merk: Kassetten indikeres i den blå boksen øverst til venstre på skjermen. Dette anbefales når man teller mindre celler eller partikler for å forbedre både kurvetilpasning evner så vel som brukerens evne til å visuelt skille nyansene av dataene.
3. Ved å øke den horisontale oppløsningen, vil skaleringen knappen dynamisk justere for å tillate sykling mellom de tilgjengelige x-aksen Skalaen går: 2-34 og 2-26 og 2-18 og 2-10 mikrometer for Type M kassetten, eller to -26, 2-18, og 2-10 mikrometer for Type S kassetten. Denne funksjonen er kun availaBle umiddelbart etter et celletall.
4. Telle informasjon (celler / ml) for kurvetilpasning eller inngjerdet område vises i en svart boks under venstre side av histogrammet. Mean cellestørrelse informasjon vises i den svarte boksen under høyre side av histogrammet.
5. Den MVI verdien vises en blå boks øverst til høyre i histogrammet. Hvis testen ble kjørt i liten partikkel-modus, vil ikke MVI ikke gjelde og vises som "MVI = SPM". I tillegg dersom konsentrasjonen av cellene er utenfor MVI driftsområdet, en melding av "MVI = Out of Range" vises.
6. Hvis du vil lagre gjeldende histogrammet, berør Ferdig ikonet. Dette sparer dataene med et navn på "Test XXX" der XXX er tilsvarende test nummer.
7. For å manuelt gate histogrammet, berør å veksle Kurvetilpasning teller resultater knappen. Dette gjør Gating standard oppkjøpet modus. Skyv deretter hver blå gating markør for å sette portene eller trykk the venstre og høyre piltast (disse vises ved å berøre den blå gating markør) for fine gate justeringer Bare cellene mellom markørene telles. Histogrammet vertikale skalaen automatisk skaleres basert på kurvetilpasning befolkning amplitude. For å justere dette vertikal skala, sveiper skjermen opp eller ned i histogrammet regionen.
8. Trykk på Gated Count resultater for å gå tilbake på skjermen til kurve modus og gjøre kurve modus standard oppkjøpet modus.
9. Deretter trykker du på Ferdig-ikonet for å lagre resultatene og gå tilbake til startskjermen. Hvis du vil slette resultatene, trykker du Slett-ikonet som helst for å permanent slette resultatene av testen.

4. Analyse av tidligere ervervede data

1. Å åpne en lagret test, trykk på Histogram symbolet på Hjem-skjermen.
2. Ikoner for opptil ni lagrede histogrammer vises på skjermen.Trykk på ikonet for test av interesse eller trykk på Page Up eller Page Down ikonene for å se flere testresultater.
3. Hver histogram vil bli åpnet i enten Curve Fit Count modus eller Gated Count modus, avhengig av hvordan den ble lagret. I Gated Count-modus, kan gating markører plasseres som ønsket å skyve hver blå gating markør uavhengig. Auto Gate ved å berøre på ønsket peak. Trykk for å veksle mellom Gated Count og Kurvetilpasning Tellermodi.
4. Trykk på Zoom og zoome ut igjen ikoner for å justere den vertikale skalaen i histogrammet. Den vertikale skalaen kan også endres ved vertikalt sveipe en finger på displayet opp (for å øke) eller ned (for å minske).
5. Trykk på Slett-ikonet for å permanent slette resultatene av testen.
6. Trykk Ferdig ikonetlukk testresultatene og gå tilbake til startskjermen. (Merk: lupebildet vil ikke bli lagret.)

5. Overføre data til en PC

1. Data kan overføres til en PC ved hjelp av Orflo Moxichart programmet eller via USB-overføring ved å plugge den Moxi Z USB-kabel til en PC eller Mac. For Bluetooth overføring (MoxiChart), første bestemme enhetens Bluetooth-ID ved å trykke på Bluetooth-ikonet på startskjermen for Moxi Z enhet.
2. På datamaskinen åpner MoxiChart programmet og klikk på Bluetooth-ikonet i øvre høyre hjørne. Deretter velger du enheten som svarer til Bluetooth IDen til Moxi Z og velger en målmappe for de opplastede filer.
3. Moxichart vil automatisk overføre alle filene til den angitte katalogen via Bluetooth-tilkoblingen.
4. Filer som overføres via Bluetooth (MoxiChart) eller USB kan åpnes og analysezed direkte med MoxiChart søknaden, fordi de er formatert. CSV-filer, kan de være direkte åpnes i Microsoft Excel eller andre data analyseprogrammer for tillegg / tilpasset analyse.

6. Representative Resultater

For å vurdere presisjon og nøyaktighet Moxi Z, tellinger av hek-293 celler, Helà celler, CHO-K1, gjær, Jurkat E6-1 celler, PC12 celler og presisjon-kalibrert perle suspensjoner med konsentrasjoner fra 0-500,000 celler / ml (Type M kassett) og 0-2-2.5e ⁶ celler / ml (Type S kassett) ble talt opp og sammenlignet ved hjelp av en Coulter Z2 og Moxi Z. Alle mammalske celler ble hentet fra den amerikanske Type Culture Collection (ATCC) og kultivert som tidligere beskrevet ^7-11. Kort, ble cellene dyrket i suspensjon i 75 mm ² vevskulturstudier flasker med sentrale medier RPMI 1640 (Jurkat E6-en, PC12), MEM (HEK-293, HelÃ) celler, eller F12K (CHO-K1) celler. Alle medier ble supplert med10% fosterets bovint serum og 100 U penicillin/100 mikrogram Streptomycin. Kolber ble opprettholdt i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO _2. Celler ble passaged hver 3. dag. Gjærceller (X5, C. albicans, 13 Vin) ble donert og brukes umiddelbart som forutsatt. Innledende eksempler konsentrasjoner på ~ 500.000 celler / ml for Type M kassett data og ~ 2-2.5e ⁶ celler / ml for Type S kassetten ble etablert ved hjelp av Coulter Z2. Etterfølgende teoretiske konsentrasjonsnivå ble forberedt gjennom seriefortynning med fysiologiske buffere (Isoton II eller Hank Balanced Salt Solution). Ved hver konsentrasjon, ble identiske prøver målt ved begge systemer og plottet mot hverandre. Som sett i Figur 2, var det en sterk lineær korrelasjon (Type M r ^2> 0,9886, Type S r ^2> 0,9781) mellom teller alle prøvene. Konsentrasjoner ble også sammenlignet med forventede / teoretisk cellekonsentrasjonen med både Moxi Z og Z2 ( 2> 0,9758, Type S r ^2> 0,9774).

For å vurdere presisjon, ble HEK-293 og Jakten celletall utført ved hjelp av Coulter Z2, Moxi Z, og en hemocytometer. Middelverdien variasjonskoeffisient (CV, n = 19) av celletall ved hjelp av Moxi Z (Type M kassett), Coulter Z2 og en hemocytometer ble beregnet med CV er målt fra 5 separate teller i 200,000-300,000 celler / ml rekkevidde. Den lille gjennomsnittlig CV (figur 4) av Moxi Z er sammenlignbar med den Z2 og er representativ for det høye nivået av presisjon bare oppnåelig med Coulter-baserte telle teknologier.

Dimensjonering presisjon av Moxi Z instrumentet ble evaluert neste gjennom måling av innkjøpte, presisjon kalibrerte polystyren perler. Gjennomsnittlig partikkelstørrelse målinger (n = 5) fra Moxi Z ble plottet mot produsentens rapporterte størrelser. Som kan sees in Figur 5, de Moxi Z målingene konsekvent matchet produsenten verdier med en høy lineær korrelasjon (r ² = 0,9989).

Utover størrelse og teller informasjon, gir Moxi Z en reagens-fri, generell vurdering av pattedyr cellekultur helse med en rapportert Moxi Livskraftig Index (MVI) verdi. Denne indeksen er generert fra en andel av antall celler i befolkningen av interesse med hensyn til de totale partikkelutslippet teller. For å demonstrere MVI måling evner, ble MVI avlesninger (Type M kassett) sammenlignet med standard manuell og flowcytometrisk levende / død måleteknikker. Populasjoner av døde (<10% levedyktig) HEK-293 og Jakten celler ble skapt gjennom natten Inkuberinger av levende celler i et næringsstoff-fri, natriumfluorid inneholder fortynningsmiddel (Isoton II, Beckman Coulter) ved 37 ° C. Kontrollerte teoretiske levedyktighet nivåer ble utarbeidet av ratiometrically blande kjente konsentrasjoner av levende og døde celler. Resulting løsninger ble analysert for levedyktighet nivåer i to eksemplarer med både hemocytometer teller og flowcytometer målinger. Hemocytometer målinger ble gjort ved hjelp av en tradisjonell 50/50 blanding av 0,1% Trypan Blå Solution og celler. Flowcytometri målinger ble gjort ved hjelp av en Guava PCA cytometer (Merck) med Viacount reagens og produsenten-spesifisert protokoll (Merck). Som vist i figur 6, var Pearson korrelasjonskoeffisient verdier (r ²⁾ "av lineær tilpasning av MVI data til analoge hemocytometer levedyktighet prosentandeler for" hek celler og Jakten celler r ² = 0.9937 og r ² = 0,9728, henholdsvis. Disse resultatene viser at denne tilnærmingen gir kulturen helseinformasjon over et bredt spekter av celle viabilities som sammenlikner positivt til de levende / døde målinger innhentet ved hjelp av en strømningscytometer eller hemocytometer.

Tabeller og tall (Fra Dittami et al, 2011.) ^15:

Figur 1. Thin-film Coulter Counting: Elektrisk strøm sendes gjennom Cell Sensing Zone av tynn-film kassett. Som celler strømme enkelt fil gjennom CSZ blir momentant økninger i spenning målt ved Moxi Z.

Figur 2. Moxi Z teller er sammenlignbare med Coulter Z2 teller. Identiske tellinger av celle-og perle suspensjoner ble talt opp ved hjelp av både en Coulter Z2 og Moxi Z. gjennomsnitt telle verdier (n = 3-4) i de Moxi Z teller ble plottet med hensyn til Coulter tilsvarende Z2 teller og R ² verdier for lineære passform ble bestemt. A) Type M kassett - konsentrasjonsområde fra 0 - 500.000 celler / ml. B) Type S kassett - konsentrasjonsområde fra 0 - 2-2.5e ⁶ / ml.Error linjene viser ± 1 standardavvik.

Figur 3. Moxi Z konsentrasjon målinger vs teoretiske cellekonsentrasjonen. A) Type M kassett - Teoretiske konsentrasjonsverdier var forberedt fra serielle fortynninger av en initial 500.000 celler / ml prøve B) Type S kassett -. Teoretiske konsentrasjonsverdier var forberedt fra serielle fortynninger av en innledende 2 - 2.5e ⁶ celler / ml prøve. Feilfelt indikere ± 1 standardavvik.

Figur 4. Variasjonskoeffisient for Coulter Z2, Moxi Z (Type M kassett), og hemocytometer. Gjennomsnittlig variasjonskoeffisient (CV, n = 19) av HEK-293 og Jakten celletall for hver tilnærming ble beregnet med CV målt fra 5 separate tellinger av HEK-293 og Jakten Celler i 200.000 - 300.000 celler / ml rekkevidde. Feilfelt indikere ± 1 standardavvik.

Figur 5. Presisjon av partikkelstørrelse målinger ved hjelp Moxi Z-Moxi Z målt perle størrelse (Type M kassett) vs produsenten rapportert perle størrelse. Feilfelt indikere ± 1 standardavvik.

Figur 6. Kultur helsevurdering ved hjelp MVI - Sammenligning av MVI målinger (Type M kassett) og Guava PCA Viacount levedyktighet versus visuelle, trypan-blå fargede levedyktighet teller ved hjelp av en hemocytometer.

Discussion

Den underliggende implementeringen av Coulter tilnærmingen kan være svært deterministisk av den samlede nøyaktigheten av målingene. En kritisk område er korreksjon av rå celletall for "tilfeldighet hendelser" der to eller flere celler samtidig passerer gjennom åpningen og måles som en enkelt elektrisk hendelse. "Kron hendelser" bidra til feil som varierer avhengig av en rekke faktorer, inkludert celle størrelse og grad av klynging (Davis et al 1967) ^6. Som et resultat, kan den nødvendige tilfeldigheter korreksjon for enhver prøven ikke kan forutses, varierende mye mellom celle / partikkel typer og med mellom ulike kulturer av identiske celletyper. Etablert teori, forankret i innledende publikasjoner av Coulter, innebærer å bruke en logaritmisk justering av de rå teller basert på antall observerte bivirkninger og en empirisk bestemt, partikkel-spesifikk korreksjonsfaktor, z. Mens nøyaktige tellinger kan være riktig oppnås med thans korreksjon algoritme, er det begrenset i den praktiske anvendelsen grunn av de store variasjonene i z-verdier mellom celletyper og tilsvarende problemer i nøyaktig forutsi dens verdi. Her med "sanne" celletall identifisert av Moxi Z kurvetilpasning i forbindelse med tilfeldigheter korreksjon algoritmen, korrigerer Moxi Z dynamisk for tilfeldigheter å oppnå de sanne konsentrasjoner. Sammenlignet med resultatene som er oppnådd ved hjelp av high-end Coulter Z2, produserte Moxi Z sammenlignbare teller over et konsentrasjonsområde fra 0 - 500.000 celler / ml (Type M kassett) og 3000 - 2-2.5e ⁶ celler / ml (Type S kassett) . Videre oppnår Moxi Z denne tellingen nøyaktighet med en tilsvarende lav variasjonskoeffisient i teller og en presisjon i partikkel dimensjonering som er karakteristisk for gullstandarden, Coulter-teknikk i celle telling.

Videre dataene som presenteres her indikerer at Moxi Z kan gi verdifull informasjonom den generelle helsen cellekulturer. Den Moxi Z utnytter kurvetilpasning tilnærming med en proprietær programvare algoritme for å avgjøre denne kulturen helsekontroll. Morfologiske endringer knyttet til celledød, som blebbing, bryte fra hverandre, og volumetriske forvrengninger (Kataoka og Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) ^12-14, gjør det mulig for Moxi-Z å skille impedimetric forskjeller mellom leve befolkninger og døde celler / rusk populasjoner. Den MVI genereres ved å analysere kulturen / partikkelstørrelsesfordelingen å identifisere de relative bidrag fra slitasjepartikler, krympet nekrotiske celler, og kurven utstyrt celle befolkning av interesse. Den MVI verdi reflekterer dermed en befolkning indeks eller ratiometric mål på monodisperse befolkning teller med hensyn til den samlede partikkel befolkning profil. Denne verdien er da algoritmer-justert basert befolkningsstatistikken og empiriske observasjoner. Because det MVI ser på parametre andre enn tradisjonelle flekker tilnærminger, er det ikke forventet å speile disse teknikkene, men i stedet gir et verdifullt alternativ visning i helsen til en cellekultur, spesielt med hensyn til rusk og mikrobielle forurensninger.

I sammendraget er Moxi-Z celleteller en svært liten Borstemmaskin instrument som gir presise og reproduserbare analyser av celletall, cellestørrelse, og celle helse ved hjelp av Coulter Prinsipp og kurvetilpasning programvare algoritmer kombinert med en patentert tynn-film sensorteknologi . Med Type M kassetten er den i stand til å telle partikler fra 4 - 25 mikron i diameter (Dynamic Range av 2 - 34 mikron), i 8 sekunder. Med Type S kassetten er den i stand til å telle partikler fra 3 - 20 mikron i diameter (Dynamic Range av 2 - 26 mikron) og i 15 sekunder. Videre utfører Moxi-Z helse vurderinger uten bruk av reagenser. Det er mye mindre arbeid intensive og subjektive enn manuell telling. I forhold til standard Coulter telling, er det Moxi raskere, betydelig mindre, gir mer informasjon, krever betydelig mindre vedlikehold, er enklere å bruke, og er en brøkdel av prisen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ORFLO Diluent	ORFLO	MXA006
Cassette Dispenser	ORFLO		Stores up to 25 cassettes for convenient dispensing
USB Cable	ORFLO		Connects instrument to PC/Mac or power adapter
Power Adapter (US and EU models only)	ORFLO		Connects USB cable to an AC outlet
USB Flash Drive	ORFLO		Stores Moxi Z software and user manual
Calibration Check Beads	ORFLO
Electronic Calibration Cassette	ORFLO		Electronic cassette for verifying proper system operation and calibration