Summary
تمليه نوعية الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) عن طريق الضغط على الفأرة اليمين مثل CF-1. وينبغي أن تعدد القدرات الداعمة للMEFs وسائل الإعلام مكيفة (CM) التي تم الحصول عليها من هذه تحتوي على تركيزات الأمثل للActivin، عفريت وTgfβ1 اللازمة لActivin / العقدية ومسارات جمعية جيل المستقبل إلى تعاونية الحفاظ على الذات وتجديد تعدد القدرات.
Abstract
بشكل عام، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والبشرية الناجمة عن الخلايا الجذعية المحفزة يمكن أن (hiPSCs) يمكن تربيتها 1 تحت ظروف متغيرة. ومع ذلك، فإنه ليس من السهل اقامة نظام فعال لزراعة هذه الخلايا. منذ الشروط ثقافة يمكن أن تؤثر على التعبير الجيني الذي يمنح تعدد القدرات في hESCs وhiPSCs، وتحسين وتوحيد أسلوب ثقافة أمر بالغ الأهمية.
وكان أول وصف لإنشاء خطوط hESC باستخدام MEFs كما الخلايا المغذية والجنين مصل بقري (FBS) المحتوية على ثقافة المتوسط 2. المقبل، واستعيض FBS مع استبدال خروج المغلوب المصل (KSR) وFGF2، مما يعزز انتشار hESCs 3. أخيرا، ونظم ثقافة التغذية الخالية من تمكن الخلايا في زراعة Matrigel المغلفة لوحات في KSR المحتوية على مكيفة المتوسطة (متوسطة مشروطا MEFs) 4. بعد ذلك، انتقلت الأوضاع ثقافة hESCs نحو ثقافة التغذية المجانية في defin كيميائياشروط إد 5-7. وعلاوة على ذلك، لتفادي تلوث محتمل من قبل مسببات الأمراض وطرق حيوان ثقافة البروتينات باستخدام xeno خالية من المكونات وضعت 8.
للحصول على تحسين ظروف قد تم استبدال الخلايا المغذية الماوس مع خطوط الخلايا البشرية (العضلات الجنين مثل خلايا الجلد و9، خلايا الجلد للبالغين 10، 11-12 الليفية القلفة، وخلايا اللحمة المتوسطة السلوي 13). ومع ذلك، فإن الحفاظ على كفاءة hESCs غير متمايزة باستخدام القلفة البشرية طبقات تغذية الخلايا الليفية المشتقة ليست مرتفعة كما أن من الخلايا المغذية الفأر نظرا لانخفاض مستوى إفراز Activin A 14. من الواضح، هناك فرق واضح في إنتاج عامل النمو عن طريق الماوس والخلايا المغذية الإنسان.
وكشفت التحليلات من transcriptomes من الفأر والخلايا المغذية الإنسان اختلافات كبيرة بين الخلايا الداعمة وغير الداعمة. الخارجية FGF2 أمر حاسم لmaintaiنينغ الذاتي تجديد hESCs وhiPSCs، وقد تم تحديدها على أنها أحد العوامل الرئيسية التي تنظم للتعبير عن Tgfβ1، وActivin والعفريت (أ خصم BMP) في الخلايا المغذية. وقد تبين Activin ألف للحث على التعبير عن OCT4، SOX2، وNANOG في hESCs 15-16.
على المدى الطويل ثقافة، ويمكن أن تنمو وhESCs hiPSCs على MEFs المعطل ميتوتيكلي] أو تحت تغذية خالية من الشروط في MEF-CM (MEF مكيفة متوسطة) على Matrigel المغلفة لوحات للحفاظ على دولتهم غير متمايزة. نجاح كل الشروط ثقافة تعتمد كليا على نوعية الخلايا المغذية، لأنها تؤثر بشكل مباشر على نمو hESCs.
هنا، نقدم أسلوب الأمثل للعزلة وثقافة من الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs)، وإعداد المتوسطة مكيفة (سم) وانزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) لتقييم مستويات Activin وضمن وسائل الإعلام.
Protocol
1. عزل الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs)
يتم تنفيذ ما يلي اثنين خطوات تحت ظروف غير معقمة.
- تضحية فأر حامل (CF1، هارلان، الولايات المتحدة) في شركة ظفار 13 أو 14 (يوم بعد coitum) بواسطة الخلع عنق الرحم.
- تشريح خارج قرون الرحم، وشطف فترة وجيزة في 70٪ (V / V) الايثانول ومكان في أنبوب الصقر تحتوي على برنامج تلفزيوني من دون كا 2 + 2 ملغ + (Gibco، إينفيتروجن).
وتنفذ الخطوات التالية في نسيج الثقافة غطاء محرك السيارة في ظل ظروف معقمة وباستخدام أدوات معقمة.
- وضع قرون الرحم في طبق بيتري، وفصل كل من الجنين والمشيمة الكيس الجنيني.
- تشريح الرأس وأجهزة أحمر، ويغسل في برنامج تلفزيوني ووضع جميع الأجنة في طبق بيتري نظيفة. اللحم المفروم ناعما النسيج باستخدام شفرة حلاقة معقم حتى يصبح من الممكن ماصة.
- إضافة 1 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA (Gibco، إينفيتروجن)، incluقرع 100 وحدة Kunitz من أنا الدناز (USB)، في جنين.
- نقل الأنسجة في أنبوب 50 مل صقر واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد كل 5 دقائق من الحضانة، وفصل الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا وافية.
- تعطيل والتربسين وذلك بإضافة نحو 1 حجم متوسط MEF الطازجة.
MEF الثقافة المتوسطة (مكونات تستخدم في صنع 500 مل من وسائل الإعلام، تخلط جميع المكونات وفلتر):
450 مل من DMEM، 50 مل من FBS (10٪ (V / V))، 5 مل 200 مم L-الجلوتامين (1/100 (V / V))، 5 مل من البنسلين، الستربتومايسين (1/100 (V / V)). - منبذة الخلايا مع السرعة المنخفضة (300 x ج)، 5 دقائق، وإزالة بعناية وطاف وresuspend بيليه خلية في المتوسط MEF دافئ.
- لوحة ما يقرب من عدد من الخلايا وهو ما يعادل 3-4 أجنة في كل قارورة (TPP) T150 المغلفة مع الجيلاتين 0.2٪ (الجيلاتين من جلد البقر، من النوع B، سيجما) لمدة 2 ساعة. والخلايا الليفية (P0، مرور 0) هي الخلايا الوحيدة التي لديها القدرة على نعلق على قوارير جيلاتين المغلفة. من الناحية المثالية، الخلايا هي 80-90٪ متكدسة بعد 24 ساعة، وفي هذه المرحلة يتم تجميد جزء كبير من الخلايا P0 للاستخدام في المستقبل.
- توسيع المتبقية T150 قارورة (ق) من P0 الخلايا حتى P3 أو P4، تعطيل ثم واستخدام ذلك لمغذيات replate hESCs أو متوسطة لانتاج مكيفة (CM).
2. تعطيل والتصفيحات MEFs (الطاعم خلايا التحضير)
وتتم جميع الخطوات في نسيج الثقافة غطاء محرك السيارة تحت ظروف معقمة.
- معطف T150 قوارير مع الجيلاتين 0.2٪ واحتضانها في RT مدة لا تقل عن 2 ساعة.
- تمييع mitomycin C في برنامج تلفزيوني (1 ملغ / مل)، ومرشح.
- نضح من وسائل الاعلام MEFs وتغسل مع برنامج تلفزيوني من دون كا 2 + + 2 ملغ.
- مكان 20 مل من المتوسط تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من C mitomycin على MEFs.
- احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية مع C mitomycin تحتوي المتوسطة ثم تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني، يعرض للتريبسين، الطرد المركزي (لمدة 5 دقائق في 300 x ج) والخلايا resuspend في المتوسط الدافئة.
- عد الخلايا وطبق في مناطق ذات كثافة من 56،000 خلية / سم 2 في T150 القوارير واستخدامها لإنتاج سم لل6 أيام التالية.
3. مكيفة متوسطة (CM) التحضير
وتتم جميع الخطوات في نسيج الثقافة غطاء محرك السيارة تحت ظروف معقمة.
- تستكمل في اليوم التالي لتصفيح MEFs المعطل في مناطق ذات كثافة من 56،000 خلية / سم 2 استبدال المتوسطة MEF مع متوسط hESC (UM والمتوسطة دون شروط) (0.5 مل / سم 2) حديثا مع 4 نانوغرام / مل من FGF2.
- جمع CM من قوارير التغذية بعد حضانة 24 ساعة وإضافة جديدة المتوسطة hESC يحتوي على 4 نانوغرام / مل من FGF2 للمغذيات.
- كرر هذا الإجراء ليوم 6 المقبل. كل مخزن يوم جمعت سم عند -20 درجة مئوية.
- بعد 6 أيام خلط جميع aliquots من المتوسط وفلتر (كورنينج، 0.22 ميكرون، PAS). جعل aliquots 50 مل ومخزن في -80 درجة مئوية.
- تكملة سم مع 4 نانوغرام إضافية / مل من FGF2 قبل إضافة إلى hESCs نمت على Matrigel. </ لى>
4. قياس Activin ألف في وسائل الإعلام مشروطة (ELISA) 15
- جمع كل العينات والكواشف إلى درجة حرارة الغرفة.
- تمييع التقاط الاجسام المضادة (الإنسان \ الفأر \ الجرذ Activin A، MAB R & D أنظمة) في برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1٪، إضافة إلى microplate (100 ميكروليتر / جيد)، وبين عشية وضحاها في احتضان RT.
- بعد 24 ساعة يغسل ثلاث مرات الآبار مع PBST (PBS مع 0.05٪ توين 20) (300 ميكروليتر / جيد) ثم كتلة (1٪ جيش صرب البوسنة / برنامج تلفزيوني و 300 ميكروليتر / أيضا) لمدة 1 ساعة على RT.
- في هذا الوقت يعد هناك Activin (R & D أنظمة) منحنى القياسية، بما في ذلك 7 التخفيفات (تركيز أقل من 30 نانوغرام / مل) وعينة فارغة. مجموعة خطي عمل Activin (أ) هو بين 0.25 و 32 نانوغرام / مل.
- إضافة نسخ من المعايير وعينات من آبار (100 ميكروليتر / جيد)، واحتضان لمدة 2 ساعة على RT.
- غسل الآبار ثلاث مرات (300 ميكرولتر من PBST).
- إضافة الثانوية (المعقدة البيروكسيديز) الأجسام المضادة (الإنسان / ماوس / فأر المعقدة البيروكسيديز Activin A، MAB R & D أنظمة) (0.25 ميكروغرام / مل 1٪ في جيش صرب البوسنة / بى بى سى) واحتضان لمدة 2 ساعة على RT.
- غسل الآبار ثلاث مرات (300 ميكرولتر من PBST)، إضافة Streptavidin-HRP (المخفف في 1٪ جيش صرب البوسنة / PBS، R & D الأنظمة)، واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
- غسل الآبار ثلاث مرات (300 ميكرولتر من PBST)، إضافة 100 ميكرولتر من حل الركيزة (Quantikine، R & D الأنظمة)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
- أضف 100 ميكروليتر من حل توقف (Quantikine، R & D أنظمة) على كل بئر وتخلط بلطف.
- مجموعة Microplate قارئ (الجزيئية أجهزة الأطياف ماكس 250، الأجهزة الطبية العالمية، وشركة في ولاية مينيسوتا) إلى 450 نانومتر، مع تصحيح في الطول الموجي 540 أو 570 نانومتر، لتحديد كثافة ضوئية من كل بئر.
5. ممثل النتائج
وتقدم الخطة الشاملة للإجراءات العزل في الشكل 1. يتم تقديم مورفولوجيا نموذجية من hESCs وhiPSCs تربيتها في ظل ظروف مختلفة في الشكل 2. ومورفولوجية ويرد MEFs والخلايا المغذية المعطلة المستخدمة في إعداد CM في الشكل 3. بشكل عام، يجب أن تكون خلايا متكدسة 24 ساعة بعد انتهاء العزلة وعلى استعداد لتجميد أو توسيعها. ومع ذلك، في بعض الأحيان قد يستغرق 2-3 أيام قبل الحصول على الثقافات متموجة. ينبغي إعداد CM من الخلايا في مرور (4) وليس في وقت لاحق. هذا أمر بالغ الأهمية لأنه لا يمكن إلا أن خلايا أولية يمكن توسيع الممرات لمدة 4-5 قبل ظهور الشيخوخة.
يعتبر خلوى، Activin A، حيث أن العامل الأكثر أهمية يفرز من قبل خلايا المغذية لدعم نمو خلايا غير متمايزة المحفزة 14. قياس مستوى Activin ألف في سم (الشكل 4) هو فحص مريحة للغاية الكمية لرصد نوعية MEFs.
الشكل 1. تمثيل التخطيطي لإجراء العزلة MEFs.
الشكل 2. ومورفولوجيا نموذجية من hESCs غير متمايزة زرعها في وجود الخلايا المغذية (A)، (ب) متوسط مكيفة والمتوسطة (C) المحددة. مورفولوجيا نموذجية من hiPSCs زرعها في وجود الخلايا المغذية (D، E).
الشكل 3. ومورفولوجيا نموذجية من الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs). (A) الممر 0 (P0) بعد يومين من الطلاء / العزلة، (ب) طبقة المغذية المعطل في مناطق ذات كثافة من 56،000 خلية / سم 2
الشكل 4. انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) القائم على قياسات تركيز Activin ألف في المتوسط مكيفة (CM) العلاقات العامةepared مع الليفية الفأر الجنينية المستمدة من سلالة الماوس CF1. وقد تم جمع CM لمدة 6 أيام وبعد ذلك تجمع. CM "1" و CM "2" تشير إلى مجموعات مختلفة من وسائل الإعلام وUM إلى وسائل الإعلام دون شروط. كما وظيفة عملية تكييف وActivin إفراز في المتوسط عن طريق MEFs، Activin وغير قابل للكشف تقريبا في ام.
Discussion
لإجراء العزل MEFs المقدمة هنا يمكن إنشاء حالة ثقافة موحدة لhESCs وhiPSCs. وعلاوة على ذلك النظام القائم على ELISA المستخدمة لتقييم إنتاج السيتوكينات من الخلايا المغذية هي مؤشر مفيد لنوعية وسائل الإعلام MEF المشتقة مكيفة. والصيانة الروتينية للسلالة الماوس (CF1) توفير الليفية دعم ضروري لتجنب دفعة إلى دفعة الاختلاف من وسائل الإعلام ثقافة. وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن لعزل الأجنة من الفئران عدة في وقت واحد للحصول على نوعية متسقة من الخلايا. يمكن أن تظل معزولة MEFs بالتأكيد الطازجة المجمدة في P0 و P1. يمكن أن تظل MEFs المعطل أيضا المجمدة في aliquots كميات مناسبة اعتمادا على الاحتياجات اللازمة لزراعة الخلايا. وينبغي عادة أن ما يقرب من 250.000 مطلي الخلايا في بئر واحدة على لوحة 6 جيدا لhESCs ثقافة وخلايا الجذع. ويمكن وبالطريقة المحددة والأمثل تستخدم بشكل روتيني للحد من التباين بين diffeاستئجار التجارب.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
شكر خاص للدكتور بوريس Greber لإقامة Activin بروتوكول ELISA كما نشرت في Greber وآخرون عام 2007. نحن ممتنون بشكل خاص إلى السيدة مونيكا Shevack لإعداد لمحة عامة رسومية. نحن ممتنون جدا لشركة فوكس الدكتور هيكو للجميع العون واقتراحات قيمة من قبل وأثناء التصوير. نود أن نشكر جميع أعضاء مختبر Adjaye، خصوصا إليزابيث سوتشا للحفاظ على امدادات ثابتة من MEFs وCM. نعترف أيضا زملائنا في منشأة حيوان من MPIMG على دعمهم الدائم. وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل جمعية ماكس بلانك و[BMBF؛ منح عدد 0315717A]، والشركاء من ERASysBio + مبادرة الدعم في إطار الاتحاد الأوروبي إيرانيت زائد مخطط في FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| beta-Mercapt–thanol | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
| Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
| Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
