Summary
محاولات للتعبير عن عبر الغشاء التليف الكيسي منظم تصرف (CFTR) في
Abstract
وعبر الغشاء التليف الكيسي منظم تصرف (CFTR) هي قناة كلوريد، أنه عندما تحور، ويمكن أن تؤدي إلى التليف الكيسي في humans.There بالتالي قدرا كبيرا من الاهتمام في هذا البروتين، ولكن تعرقلت جهود لدراسة بنية ونشاط من جانب صعوبة للتعبير عن وتنقية كميات كافية من البروتين 1-3. مثل: "من الصعب" العديد من بروتينات الغشاء حقيقية النواة، وحرية التعبير في كائن حي ينمو بسرعة غير مرغوب فيه، ولكن التحدي، وخميرة في S. خميرة، حتى الآن تم الحصول على كميات منخفضة ولوحظ التدهور السريع للبروتين المؤتلف 4-9. وقد وصفت البروتينات تشارك في تجهيز CFTR المؤتلف في خميرة 6-9. وفي هذا التقرير وصفنا منهجية للتعبير عن CFTR في الخميرة وتنقية لها بكميات كبيرة. بروتوكول يصف كيف يمكن التغلب على المشاكل في وقت سابق من التحلل البروتيني ومستويات التعبير كيف منويمكن CFTR تحسنت كثيرا من خلال تعديل شروط نمو الخلايا وعن طريق التحكم في ظروف الاستقراء، ولا سيما في الفترة الزمنية قبل حصادها الخلية. وreagants المرتبطة بهذا البروتوكول (الفئران CFTR في التعبير عن خلايا الخميرة البلازميدات أو الخميرة) سيتم توزيعها عن طريق مؤسسة التليف الكيسي الولايات المتحدة، التي رعت هذه البحوث. وسيتم نشر مقالة تصف بناء المستخدمة في تصميم وتجميع CFTR في هذا التقرير بشكل منفصل (Urbatsch، أولا؛. Thibodeau، P. وآخرون، غير منشورة). في هذه المقالة سوف نشرح طريقة بدايتنا مع التحول من خلايا الخميرة مع CFTR بناء - الخميرة التي تحتوي على البلازميد (الشكل 1). والتصور لديه أخضر فلوري البروتين (GFP) تسلسل تنصهر في النهاية إلى CFTR-C، ويتبع نظام التي وضعتها درو وآخرون (2008) 10. وGFP يسمح الواجب اتباعها في التعبير وتنقية CFTR بسهولة نسبيا. وتصور protoc [جوف]رأ التشطيبات بعد إعداد microsomes ل من خلايا الخميرة، على الرغم من أننا تتضمن بعض الاقتراحات لتنقية البروتين من microsomes ل. القراء قد ترغب في إضافة التعديلات الخاصة بها لإجراء تنقية microsome، اعتمادا على التجارب النهائية التي ستنفذ مع البروتين والمعدات المحلية المتاحة لهم. ويمكن للخميرة، أعرب عن بروتين CFTR المنقى جزئيا باستخدام معدن أيون التقارب اللوني، وذلك باستخدام تنقية polyhistidine جوهري العلامة. لاحق الحجم استبعاد اللوني ينتج بروتينا يبدو أن> 90٪ نقية، كما ترى SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ من هلام.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام والمخازن
- YNB: للحصول على لتر واحد، وتعليق 6،9 النيتروجين خميرة ز قاعدة بدون الأحماض الأمينية و 0.77 غرام مزيج تكملة كاملة دون اليوراسيل في الماء ل 1. الأوتوكلاف. تخزن في درجة مئوية 4
- YNBA: للحصول على 400 مل، بتعليق 2.76 النيتروجين خميرة ز قاعدة بدون الأحماض الأمينية، 0،38 غرام مزيج تكملة كاملة دون اليوراسيل و8G أجار الجرثومية في مل من الماء 350. الأوتوكلاف. خلط 8 الجلوكوز غ مع 50 مل ماء والحرارة بلطف حتى حل. Sterilise من خلال مرشح ميكرون 0.2 و إضافة إلى YNBA بينما أجار غير منصهرة. تخزن في درجة حرارة الغرفة.
- 20٪ متوسط نسبة الجلوكوز: للحصول على 500 مل، مزج 100 غرام جلوكوز مع YNB 500 مل والحرارة بلطف حتى حله. تمر من خلال مرشح ميكرومتر 0.2 في زجاجة دوران عقيم. تخزن في درجة حرارة الغرفة.
- خلط للحصول على 2 ليتر، 400 غ سكر اللبن مع YNB 2L والحرارة بلطف حتى حل: 20٪ متوسط الجالاكتوز. تمر من خلال مرشح ميكرون 0.2 في زجاجة دوران عقيم. متجر في المزاج غرفةature.
- أسهم المانع البروتيني: CFTR هو عرضة للتحلل البروتين 4. وجد الباحثون أن مثبطات بعد أن تكون فعالة في الحد من التحلل البروتيني، على الرغم من القراء قد يرغب في صياغة هذه القائمة لتلبية الاحتياجات الخاصة بهم. متجر في 100 aliquots ميكرولتر في -20 درجة مئوية للحد من تجميد ذوبان المشاكل. وينبغي أن يخفف من جميع مثبطات الحلول الأسهم إلى تركيز العمل على النحو التالي:
| المانع | الأسهم تركيز | تحضير الأوراق المالية | تركيز العمل |
| AEBSF | 200 ملي مول | 48mg حل في الماء المقطر 1ml | 0.2 ملم |
| Benzamidine | 300 ملم | 36mg حل في الماء المقطر 1ml | 0.3 مم |
| Chymostatin | 4 ملم | حل 2.5mg في 1ml DM جافSO | 4 ميكرومتر |
| E-64 | 7 ملم | 2.5mg حل في الماء المقطر 1ml | 7 ميكرومتر |
| Leupeptin | 20 ملي مول | 10mg حل في الماء المقطر 1ml | 20 ميكرون |
| Pepstatin A | 15 ملم | حل 10mg في DMSO 1ml جاف | 15 ميكرومتر |
| PMSF | 1 م | حل 174mg في DMSO 1ml جاف | 1 مم |
- DTT (1 م): 154 ملغ dithiothreitol ذوب في الماء المقطر 1ml. مخزن عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. وأشار استخدم في تخفيف 1:1000 في المخازن.
- EDTA (0.5 م): مزيج حمض ز 29.22 ethylenediaminetetraacetic مع ماء 100 مل. إضافة 10 N هيدروكسيد الصوديوم قطرة قطرة حتى كل من EDTA قد حلت، ودرجة الحموضة يصل إلى 8. جعل ما يصل الى 200 مل مع الماء وتمر من خلال 0.2 ميكرون مرشح في زجاجة دوران عقيم. تخزن في درجة حرارة الغرفة.
- CRB (300 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك،درجة الحموضة 7.4، 0.56 M السوربيتول، 1 ملم EDTA): ذوب 18،17 ز تريس القاعدة في مل من الماء 350 و ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 قبل إضافة حمض الهيدروكلوريك. إضافة 51،35 ز السوربيتول وجعل حجم ما يصل الى 500 مل مع الماء. الأوتوكلاف. إضافة 1 مل من محلول EDTA الأوراق المالية ومخزن في 4 درجات مئوية.
- CFTR العازلة (50 ملم تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 10٪ V / V الجلسرين): ذوب 6،06 ز تريس القاعدة في 500 مل من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 8 مع حمض الهيدروكلوريك، إضافة 100 مل من الجلسرين، وجعل ما يصل إلى 1 لتر بالماء. الأوتوكلاف ومخزن في درجة مئوية 4
- 2X صبغ الحمل: 50 مم تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.6)، الجلسرين بنسبة 5٪، 5 مم EDTA (درجة الحموضة 8.0)، 0.02٪ زرقة البروموفينول، SDS 4٪، 0.05 متر DTT. جعل 10 مل، قسامة وتخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
2. فحص Transformants
هذا البروتوكول يفترض أنه تم إدراج هذا الجين الانصهار CFTR-GFP-8His الى المصب خميرة البلازميد إلى مروج الجالاكتوز GAL1 (Fig.1) والتي تم تحويلها من البلازميد إلى FGY217 الخلايا، حذف Pep4 متحولة من S.cerevisiae 10 وآخرون (2008) 10.
- اختيار جيد 5-10 فصل المستعمرات من لوحة التحول. نقل كل مستعمرة إلى 50 أنبوب منفصل معقم الصقر مل تحتوي على 9 مل YNB و1ml من متوسط نسبة الجلوكوز بنسبة 20٪. لهذه الخطوة، فمن المهم أن يكون هناك تركيز النهائي من الجلوكوز 2٪ (W / V) في الثقافة للحفاظ على نمو الخلايا. تنمو بين عشية وضحاها لمدة 16 ساعة في 250 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية في حاضنة المدارية اهتزاز.
- جعل أسهم الجلسرين لكل من المستعمرات فرزهم. إضافة جو معقم و مطهر 0.8 مل من الثقافات بين عشية وضحاها إلى الجلسرين 0.2 مل العقيمة في قارورة المسمار أعلى وصفت، لفترة وجيزة، ومخزن في دوامة -80 درجة مئوية.
- تمييع الثقافات المتبقية بين عشية وضحاها إلى وحدة تخزين النهائي من 50 مل في YNB، بما في ذلك 250 ميكرولتر من متوسط نسبة الجلوكوز 20٪.لهذه الخطوة، فإنه من المهم أن نعمل على تخفيف تركيز السكر إلى ما يقرب من 0.1٪ (وزن / وزن) في الثقافة بسبب ارتفاع نسبة الجلوكوز يمكن قمع المروج GAL1 10. حيرة تنمو الثقافات في المسمى مخروطي 250 مل قوارير إلى OD 600 من 0،7-0،8 في 250 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية في حاضنة المدارية اهتزاز.
- حمل الثقافات من خلال اضافة 5 مل المتوسطة الجالاكتوز 20٪ على كل قارورة، وتنمو على لمدة 16 ساعة.
- تأكيد التعبير عن CFTR باستخدام المجهر مضان. أخذ 100 ميكرولتر من الثقافة وإضافة 100 الجلسرين ميكروليتر إلى الحد من تنقل الخلية في الحل. تحليل الخلايا على مجهر الرؤية دلتا استعادة RT (أو ما شابه)، وذلك باستخدام الليزر الأزرق تحت التصفية FITC (الطول الموجي من 490 نانومتر الإثارة وطول موجة من الانبعاثات من 528-538 نانومتر). وينبغي التعبير الإيجابي للانصهار بروتين CFTR-GFP تكون واضحة وحلقة من التألق في الغشاء البلازمي للخلايا الخميرة. ويمكن استخدام خلايا الخميرة Untransformed كمجموعة تحكم.
- نقلالثقافات في أنابيب الصقر 50ml. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 3500 XG، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق في مقعد أعلى الطرد المركزي. في حين أن أجهزة الطرد المركزي قيد التشغيل، وإعداد أنابيب microfuge 2 مل مع قمم المسمار التي تحتوي على ما يقرب من 500 ميكرولتر الخرز الزجاجي للحمض غسلها ومكان على الجليد. تجاهل supernatants وresuspend كل بيليه في 500-800 CRB المثلج ميكرولتر مع مثبطات الأنزيم البروتيني. نقل تعليق للأنابيب microfuge التي تحتوي على الخرز والحفاظ على الجليد.
- ليز الخلايا عن طريق هز بقوة / vortexing كل أنبوب microfuge لمدة 10 فترات من 30 ثانية، ويستريح على الجليد في ما بين الفترتين. ويمكن استخدام beadbeater كبديل، مثلا beadbeater BioSpec مصغرة تعمل لمدة 3 دقائق.
- وضع أنابيب في microfuge الفوق والطرد المركزي في 3500 XG، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. نقل supernatants التي تحتوي على عدد السكان غشاء الخام لتنظيف أنابيب microfuge ومكان على الجليد. إضافة 500 ميكروليتر جديدة الجليد المشتركLD CRB مع مثبطات الأنزيم البروتيني إلى كل أنبوب وتكرار هذه العملية لتجميع الأغشية.
- جمع الأغشية الخام الغزل في أقصى سرعة، 4 درجات مئوية في microfuge الفوق لمدة 2 ساعة. تجاهل طاف وresuspend كل بيليه في 50 العازلة الجليد CFTR الباردة ميكرولتر.
- في أنابيب microfuge نظيفة، وخلط 15 ميكرولتر من كل تعليق مع 15 ميكرولتر صبغ تحميل 2X بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. لا تغلي العينات، وهذا سوف يسبب بروتينات غشاء CFTR وغيرها لتشكيل SDS-غير قابلة للذوبان المجاميع وتفسد أيضا سمة GFP.
- تحميل عينات مع PageRuler زائد معايير بروتين prestained (Fermentas) على مادة هلامية 4-20٪ التدرج تريس / جليكاين (NuSep) وتشغيل عند 150 V لمدة 40 دقيقة أو حتى الجبهة صبغ هو في الجزء السفلي من الجل.
- التعرف على أعلى معربا عن الخلايا التي في جل مضان. مكان في نظام التصوير مضان مثل ماسح ضوئي الاعصار. مسح يو هلامغناء الليزر الأزرق في طول موجي للإثارة من 488 نانومتر، والطول الموجي الانبعاثات من 526 نانومتر. ينبغي للانصهار CFTR-GFP تكون واضحة في حوالي 220 كيلو دالتون. سيكون هناك أيضا فرقة فلوري ضعيفة وضوحا في حوالي 70 كيلو دالتون التي ربما هي خميرة جوهري FAD المحتوية على بروتين غشاء (مثل الوحيدات نازعة سكسينات A) 11،12.
- وصمة عار في هلام مع Coomassie، يزيل اللون ومسح هلام للمقارنة لفحص مضان باستخدام عرض صورة مريحة مجموعة من البرامج. الجل Coomassie الملطخة يسمح بتقييم نسبي من مستويات التعبير CFTR-GFP في مختلف خطوط نسيلي بعد تطبيع لكمية البروتين الكلي تحميلها على كل مسار من هلام.
- خط خارج خط خلية أعلى تعبير من المخزون الجلسرين لها (2.2) في الصعود إلى YNBA جديدة لوحة واحتضانها في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 2-3 أيام. قد ثم يتم تخزين هذه لوحة لمدة تصل الى 2 أسابيع في درجة مئوية 4
3. على نطاق واسع جهاز التخمير عبادةلدى عودتهم
- إعداد ما قبل الثقافات للتخمير. كشط 1cm 2 مجال الخلايا من YNBA لوحة (2.13) باستخدام حلقة عقيمة وإضافة إلى YNB مل 45 و 5 مل المتوسطة الجلوكوز 20٪، على ان يكون التطوير التنظيمي 600 هو 0.1 تقريبا. تنمو في 250 مل من قوارير مخروطي حيرة في 250 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية في حاضنة المدارية تهتز حتى تصل إلى 600 OD 1.
- انقسام بين اثنين من ثقافة مخروطي L 2 حيرة قوارير تحتوي كل منها على 450 مل و 25 مل YNB المتوسطة جلوكوز 20٪. تنمو هذه على نحو 250 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية في حاضنة المدارية تهتز حتى تصل إلى 600 OD 1.2.
- بينما هذه الثقافات ما قبل تنمو، وإعداد تخمير. جعل 11.2l من YNB كما هو موضح في 1.1، ولكن حل إضافي 8،28 ز YNB و 0.95 غرام التسرب تكملة للتعويض عن إضافة الجلسرين على الاستقراء. إضافة جو معقم و مطهر لل11،2 لتر YNB و 75 مل المتوسطة الجلوكوز 20٪ إلى سفينة تخمير 20L معقمة وضبط درجة الحرارة إلى تشغيل30 درجة مئوية.
- إضافة جو معقم و مطهر للprecultures للتخمير وتعيين سرعة التحريك إلى ما يقرب من 800 دورة في الدقيقة، والحفاظ على درجة الحرارة عند 30 درجة مئوية. وينبغي أن الهواء المضغوط يتدفق في ما يقرب من 15 دقيقة دسم 3 -1. وبمجرد أن يصل إلى ثقافة تخمير OD 600 من 1.2، حث بإضافة جو معقم و مطهر 1.5 لتر YNB حل الجالاكتوز 20٪ و 1.2 لتر الجلسرين. خفض درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية وتنمو ثقافة لمدة 16 ساعة.
- نقل محتويات تخمير إلى مبرد الطرد المركزي قدور 1L على الجليد باستخدام مضخة تمعجية. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3500 XG، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في الدوار سعة كبيرة (على سبيل المثال 6 لتر). Resuspend الخلايا في 150 مل CRB الجليد الباردة مع مثبطات الأنزيم البروتيني. من هنا، ينبغي أن يتم العمل بها في كل درجة مئوية 4
- ليز الخلايا التي يمر ديسروبتر ثابت الخلية الأنظمة في 4 تمريرات في 25 و 32 و 30 و 35 كيلو باسكال، وجمع والمحللة على الجليد في كل حالة على حدة. بدلا من ذلك، استخدم بيات حبةص (Biospec) مع حجم مساو من حامض يجرفها الخرز الزجاجي 0.5 ملم، وتستنهض الهمم لمدة 3 دقائق على كامل السلطة. نقل المحللة لأنابيب الصقر 50ml و بيليه حطام خلية بواسطة الطرد المركزي في 3500 XG، 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في جهاز للطرد المركزي الفوق.
- نقل وطاف على أنابيب الطرد المركزي المبردة. الطرد المركزي في 14000 XG، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في جهاز للطرد المركزي لإزالة الميتوكوندريا.
- نقل طاف على أنابيب منبذة فائقة مبردة. الطرد المركزي في 200000 XG، 4 درجات مئوية لمدة 90 دقيقة في منبذة فائقة على جمع microsomes ل.
- صب بعناية والتخلص من طاف وإضافة 2ml العازلة CFTR الجليد الباردة مع مثبطات الأنزيم البروتيني وDTT 1MM على كل أنبوب. resuspend بلطف الكريات باستخدام فرشاة الرسام، وأعلى ما يصل كل أنبوب مع عازلة CFTR ومزيج باستخدام خلاط دوامة.
- منبذة التعليق على 200000 XG، 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة في منبذة فائقة، تجاهل الكريات طاف وresuspend في 2 مل الجليد الباردة ث العازلة CFTRمثبطات الأنزيم البروتيني إيث (لا DTT) باستخدام فرشاة الرسام.
- تجمع microsomes ل معلق، وتعديل حجم النهائي الى 50 مل مع عازلة CFTR وتخلط جيدا. الاحتياطي قسامة 1 مل لتحليل هلام SDS-PAGE، كما هو موضح في 2،9-2،11. يمكن أن تكون الآن microsomes ل فلاش مجمدة في النيتروجين السائل ثم تخزينها في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
- ويمكن استخراج CFTR من microsomes ل باستخدام واحدة من المنظفات التالية: الليثيوم perfluorooctonoate حامض (LiPFO)، tetradecanoly-lyso-phosphatidylglycerol (LPG14)، N-دوديسيل-β-D-maltoside (DDM). تخلط مع microsomes ل العازلة CFTR، مثبطات الأنزيم البروتيني، والمنظفات بنسبة 5٪ (وزن / وزن). إذا تم استخدام DDM، إضافة أيضا 300 مم كلوريد الصوديوم إلى المخزن المؤقت. تستنهض الهمم في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على محور دوار أنبوب.
- منبذة العينات في 100000 XG، 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة في منبذة فائقة. تحتفظ طاف واتخاذ قسامة صغيرة لتحليل هلام SDS-PAGE. وربما تكون الآن CFTR يمكن تنقيته من المواد المعدنية التي solublised يجمدبعد التقارب اللوني بواسطة اللوني حجم الإقصاء.
4. ممثل النتائج
التحول من الخميرة مع البلازميد CFTR المحتوية ليست فعالة بنسبة 100٪. وسيقوم ممثل صغار شاشة التعبير CFTR في المستعمرات المختارة من تجربة التحول تسفر عن 1 من كل 4 مستعمرات التعبير عن بروتين. ويبين نتيجة نموذجية من شاشة من 5 مستعمرات التقطت من لوحة في لوحة ألف من الشكل. 3. واحدة من المستعمرات يظهر بمستوى عال من التعبير عن انصهار بروتين CFTR-GFP الذي يمتد عادة بين 250 كيلو دالتون وعلامات كيلو دالتون 130، كما هو مبين. سوف CFTR-GFP مستويات مضان تختلف اختلافا كبيرا بين التجارب، مع مستعمرة 4 في الشكل. 3 عرض ما لا يقل عن 10X أكبر مضان من الفرقة فلوري جوهري في حوالي 70kDa. إذا كانت مستويات التعبير عن CFTR-GFP يبدو أن تعطي أقل مضان من الفرقة 70 كيلو دالتون، ومن ثم ربما تستحق إعادة تحويل واختيار مستعمرةمع مستويات أعلى من CFTR-GFP التعبير. كما هو مبين في الشكل. 3A، فإنه من غير المحتمل، حتى مع وجود مستوى عال من التعبير CFTR-GFP، أن الفرقة CFTR-GFP سيكون ملحوظ في استخراج الخلايا بواسطة تلطيخ Coomassie.
مرة واحدة قد نمت المستعمرات المختارة في تجارب على نطاق أوسع، وmicrosomes ل معزولة، وجود CFTR-GFP داخل microsomes ل سوف تحتاج إلى تقييم، كما هو مبين في الشكل. 3B. نتائج هذه التجربة مهمة، ليس فقط لتقييم كفاءة تحريض التعبير، ولكن أيضا للتأكد من أنه تم إعداد microsomes ل بعناية و قد تم تصغير أن التحلل البروتيني. النتائج هو مبين في الشكل. 3B يعني أن في هذه التجربة التعبير CFTR-GFP أقل بعض الشيء (كما ترى نسبة إلى الفرقة 70kDa الذاتية) مما كان عليه في التجربة على نطاق صغير هو مبين في ألف لوحة ولكن منحازة هذا الانطباع من التعرض المفرط للكشف عن التألق في هذه قياس. وكان هذا لأن المجرب كان checkiنانوغرام عن وجود شظايا من بروتين CFTR بناء. هناك بعض الأدلة في هذه التجربة لبعض أجزاء بروتين فلوري بين 130 كيلو دالتون وعلامات كيلو دالتون 100، ولكن هذه هي ضعيفة جدا بالمقارنة مع الفرقة CFTR-GFP كامل طول. مع مثبطات الأنزيم البروتيني وصفها هنا، نجد القليل من الأدلة لتدهور بروتين من CFTR بعد كسر الخلية. إذا لوحظ التحلل البروتيني كبيرا، نوصي جعل الطازجة حلول الأوراق المالية البروتيني المانع. لقد وجدنا أيضا أن تجاري أقراص كوكتيل البروتيني المانع ليست فعالة كما لهذا النظام. نمو الخلايا بعد 16 ساعة وسوف (ما بعد الاستقراء) أن تؤدي إلى التعبير CFTR انخفضت كما هو مبين في الشكل (4). هذا ربما يرجع إلى دوران من البروتين، وربما بسبب upregulation من آلية بروتين خميرة مراقبة الجودة 6-9،13. ولذلك يستحسن لرصد مستويات التعبير CFTR بعد الاستقراء مع الجلاكتوز، إذا كان ذلك ممكنا، حيث أن الوقت الأمثل لحصاد الخلايا أماهذ تختلف من مختبر إلى آخر.
الشكل 1. إن البناء المحتوية على الخميرة CFTR البلازميد. يتم إدراج الانصهار CFTR-GFP-8His في ناقلات 2μ التعبير p424GAL1، تحت سيطرة أحد المروجين (GAL1) الجالاكتوز. الموجه يحتوي أيضا على علامة اختيار اليوراسيل (URA) والجينات المقاومة الأمبيسيلين (الأمبير).
الشكل 2. مخطط انسيابي تلخيص بروتوكول تصور.
الشكل 3. ممثل SDS-PAGE المواد الهلامية التعبير CFTR وتنقيتها. لوحة ويظهر 5 اختار عشوائيا المستعمرات transformant (الممرات 1-5) التي تم فحصها للكشف عن التعبير CFTR. لوحة يظهر microsomes ل B التي تم عزلها من آلية سعر الصرف الثابت 15Lأدخل ثقافة. لوحة C يظهر تنقية CFTR الفئران التي تم الحصول عليها بعد مرحلتين تنقية باستخدام اللوني التقارب اللوني تليها حجم الإقصاء. وتظهر جميع المواد الهلامية في ظل ظروف إضاءة مضان مثيرة من المجال GFP (يسار) وبعد Coomassie صمة عار (يمين). يتم سرد المواقع النسبية لمعايير الوزن الجزيئي على اليسار (قده).
الشكل 4. بيانات تمثيلية للتعبير عن CFTR في الخميرة. لوحة ويظهر مرة وبالطبع التعبير CFTR بعد الاستقراء مع اللبن. وقد تم تحليل مستخلصات الخلية بواسطة SDS-PAGE، وتتكامل في ما بينها ومضان GFP للفرقة بروتين CFTR-GFP. B لوحة تظهر نتائج نموذجية للفحص المجهري مضان من GFP، معربا عن الخلايا الاستقراء آخر 16 ساعة. عادة، سوى جزء صغير من الخلايا التعبير عن CFTR عند مستويات مرتفعة.
Discussion
وتقدم هذه الورقة طريقة للتعبير عن بروتين CFTR الفئران في خلايا الخميرة، والتي ينبغي أن تسهل البحث عن التليف الكيسي. والهدف هو ربط هذه الورقة مع الافراج عن التركيبة الفئران CFTR الحمض النووي، والتي سوف تكون متاحة من خلال مؤسسة التليف الكيسي ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). وينبغي أن orthologs أخرى تصبح متاحة في وقت لاحق. التحول من خلايا الخميرة مع ناقلات CFTR المحتوية على واضحة ومباشرة، ولكن من المهم للكشف عن المستعمرات معربا عن مستويات عالية من CFTR. قد مستويات التعبير متغير تنشأ عن عدة عوامل، ولكن عدد النسخ من الخلية في البلازميد يمثل ربما للحصول على درجة كبيرة من الاختلاف. وينبغي أن الخطوات الحاسمة وصفها هنا تسمح إنتاج CFTR في التعبير عن خلايا الخميرة وCFTR التي تحتوي على أغشية الميكروسومي. بمجرد يتقن التحول والنمو والحصاد وتحلل من خلايا الخميرة، purifوينبغي أن ication من البروتين يكون من الممكن، وفي الشكل 3 اعطينا مثالا للنقاء التي ينبغي أن تكون قابلة للتحقيق في هذه القضية باعتباره مرجعا مفيدا. انه ليس في نيتنا في هذه المخطوطة لتوفير منهجية مفصلة لتنقية هذا البروتين. ومع ذلك، هناك بعض الخطوات الهامة تنقية المصب التي هي محددة لنظام التعبير S.cerevisae، مثل انحلال الخلايا وتنقية microsome، وأدرجت هذه بالتفصيل في هذه المخطوطة. وتجدر الإشارة، مع ذلك، أنه وبصرف النظر عن طريقتين نحن قد استخدمت، ويمكن أن تستخدم الطرق البديلة لتعطيل خلية الخميرة، مثل استخدام خلية ضغط الفرنسية. البروتين المؤتلف لديه TEV-شطورة نطاق GFP محطة C-التي تتيح لتعقبها البروتين بعد الاستقراء (الشكل 4). خميرة لديها البروتين جوهري 70kDa (سكسينات ربما نازعة 12) أن fluoresces في ظل نفس الظروف 11، وهذا يمكن أن توفر في جملة مفيدةنال القياسية لمعايرة مستويات التعبير النسبية للCFTR في مقتطفات خلية كاملة أو microsomes ل (الشكل 3). ويتضح من البيانات التي تظهر في الشكل (4) أن توقيت الحصاد الخلية بعد الاستقراء مع الجلاكتوز أمر بالغ الأهمية. غلة انخفاض CFTR حادا بعد حوالي 16 ساعة من الاستقراء، حتى لا يكون هناك بالكاد أي CFTR التي يمكن اكتشافها في خلايا الخميرة بعد 24 ساعة من الاستقراء.
العائد من تنقية بروتين حوالي 1-2mg بروتين CFTR بنسبة 15 ثقافة تخمير لتر. ويمكن تقدير انتعاش بها نحو 70٪ من البروتين CFTR-GFP مجموع ما يصل الى مرحلة microsome، واستعادة حوالي 25٪ من البروتين النقي. توصيف س. خميرة، وأعرب CFTR لا تزال مستمرة. كما رأينا في الشكل. 4، ويمكن رصد موقع على البروتين في الخلية بواسطة الفحص المجهري مضان. على الرغم من أن وجدت الكثير من مضان حول المحيط الخارجي للخلية من 10 المتوقعة، وبعض من البروتين يعرض توطين منقط، إما في، أوفقط داخل غشاء البلازما التي يمكن أن تكون بسبب CFTR إعادة التدوير من خلال مسار جولجي / endosomal أواخر 14 أو ربما في اتجاه مجرى النهر مقصورة من الناشئين من حويصلات النقل من لائحة 4. وأظهرت المعاملة مع PNGaseF، وهو الانزيم الذي deglycosylates البروتينات، والحد الأدنى من التغيير في الهجرة من الفرقة بروتين CFTR في SDS-PAGE، مما يدل على أن يتم unglycosylated عليه، أو لديه ارتباط بالغليكوزيل الحد الأدنى 15. تجارب على الدولة الفسفرة من البروتين لا تزال جارية. في بعض المنظفات اختبارها حتى الآن، وهو البروتين النقي يعرض أتباز النشاط (هو تحول دون ذلك من قبل المانع CFTR محددة 16) بمعدلات مماثلة لتلك التي سبق نشرها 2،15. وقياس نشاط قناة CFTR تتطلب إعادة تشكيل البروتين المنقى، وهذا يعني خطوة تنقية النهائي في المنظفات التي تحتوي على تركيز عال نسبيا micelle الحرجة (CMC) 17. خميرة microsomes ل containinويمكن solublised ز CFTR مع العديد من المنظفات المستخدمة عادة 18، بما في ذلك المنظفات مثل maltoside دوديسيل 2، والتي تعتبر عموما أن يكون "معتدل". ومع ذلك فقد أثبتت اللجنة العسكرية المركزية المنظفات معظم عالية لتكون فعالة للsolubilsation، حتى الآن، مما يشير إلى أنه ينبغي النظر إلى تبادل هذه المنظفات في مرحلة متأخرة في أي مخطط لتنقية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر مؤسسة التليف الكيسي (CFF) لتمويل هذا العمل من خلال كونسورتيوم لها CFTR هيكل 3D (منح عدد FORD08XX0). نحن نعترف بمساهمة كبيرة من جميع زملائنا في اتحاد لهذا العمل، ولا سيما في تصميم من الجينات CFTR. نحن نعترف أيضا مساهمات لا تقدر بثمن من الدكاترة. جيمس Birtley (NCSR Demokritos، اليونان)، مارك يونغ (جامعة كارديف، المملكة المتحدة) وديفيد درو (امبريال كوليدج في لندن، المملكة المتحدة) في المراحل الأولى من العمل. نشكر خصوصا الدكتور إينا Urbatsch (تكساس للتكنولوجيا. جامعة، لوبوك) لقراءة نقدية للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | |||
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| D-galactose | Fisher | BP656-500 | |
| D-glucose | Fisher | D16-500 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Tris-HCl | Fisher | P631 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Glycerol | Fisher | 065017 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 | |
| Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| 50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 | |
| 250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 | |
| 2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 | |
| 2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| 1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | ||
| Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | ||
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Vortex mixer | Star Labs | ||
| Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 | |
| LAS3000 imaging system | Fuji | ||
| 20l fermenter vessel and control unit | Applikon | ||
| Constant systems cell disrupter | Constant systems | ||
| Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| 50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
References
- Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. CFTR three-dimensional structure. Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).
- Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling. Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).
- Kiser, G. L. Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).
- Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).
- Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).
- Fu, L., Sztul, E. ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy. Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).
- Sun, F. Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants. J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).
- Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. CFTR expression and ER-associated degradation in yeast. Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).
- Drew, D. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).
- Knight, A. W., Billinton, N. Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).
- Robinson, K. M., Lemire, B. D. Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit. J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).
- Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on. the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).
- Yoo, J. S. Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway. J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).
- Zhang, L. Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding. Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).
- Wellhauser, L. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).
- Ramjeesingh, M. A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).
