Summary
Schistosoma mansoni eieren zijn krachtige stimulatoren van de T-helper type 2 (Th2) immuunrespons, kenmerk van parasitaire infecties, astma en allergische ontsteking. Dit protocol maakt gebruik van S. mansoni ei injectie om een CD4 Th2 cytokine-geïnduceerde ontstekingsreactie in de long, gekenmerkt door long granuloomvorming rond het ei, eosinofilie en macrofaag alternatieve activatie te genereren.
Abstract
Schistosoma parasieten zijn bloed staartvinnen die naar schatting 200 miljoen mensen wereldwijd een infecteren. In chronische infectie met Schistosoma de ernstige pathologie, zoals leverfibrose en Splenomegalie, wordt veroorzaakt door de immuunreactie tegen het parasieteneitjes dan de parasiet zelf 2. Parasieteneitjes induceren Th2 respons gekenmerkt door de productie van IL-4, IL-5 en IL-13, de andere activering van macrofagen en de rekrutering van eosinofielen. We beschrijven hier de injectie van Schistosoma mansoni eieren als een model om parasiet-specifieke Th2 cytokine reacties in de longen en de drainerende lymfeklieren, de vorming van pulmonaire granulomen rondom het ei, en luchtwegontsteking te onderzoeken.
Na intraperitoneale sensibilisatie en intraveneuze uitdaging, S. mansoni eieren worden vervoerd naar de longen via de longslagaders waar ze worden gevangen in het longparenchymdoor granulomen samengesteld uit lymfocyten, eosinofielen en alternatief geactiveerde macrofagen 3-6. In verband met granuloomvorming, ontsteking in de broncho-alveolaire ruimtes, uitbreiding van de drainerende lymfeklieren en CD4 T-cel activatie kan worden waargenomen. Hier hebben we details van het protocol voor het isoleren van Schistosoma mansoni eieren van besmette levers (gemodificeerd uit 7), sensibiliserende en uitdagend muizen, en het herstellen van de organen (broncho-alveolaire lavage (BAL), long-en drainerende lymfeklieren) voor analyse. We hebben ook vertegenwoordiger van histologische en immunologische gegevens en suggesties voor aanvullende immunologische analyse.
Over het algemeen deze methode zorgt voor een in vivo model om helminth geïnduceerde immunologische responsen te onderzoeken in de longen, dat in grote mate van toepassing zijn op de studie van de Th2-inflammatoire ziekten, waaronder worminfecties, fibrotische ziekten, allergische ontsteking en astma. Voordelen van dit model voor de studie van type 2 ontstekingen in de longen zijn de reproduceerbaarheid van een krachtige Th2 ontstekingsreactie in de long en drainerende lymfeklieren, het gemak van de beoordeling van de ontsteking door histologisch onderzoek van de granulomen rondom het ei, en het potentieel voor lange termijn opslag van de parasiet eieren.
Protocol
1. Zuiverende Schistosoma mansoni eieren
- Infect Zwitserse muizen met Webster Schistosoma cercariae, de fase van de infectieuze Schistosoma levenscyclus 8. Als alternatief krijgen schistosoma-geïnfecteerde muizen uit de NIAID Schistosomiasis Resource Center ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). Laat muizen 6-7 weken na infectie, waarbij de tijd-punt eieren in de lever en kan teruggewonnen zoals hieronder beschreven worden (zie Fig. 1).
- Euthanaseren muizen met CO 2, en bevochtig met 70% ethanol. Plaats de muis op de rug. Gebruik stompe tang en schaar weg te snijden huid en de onderliggende buikvlies. Accijnzen de lever, die zich onder de ribbenkast en het middenrif.
- Fijn gehakt lever en voeg 20 ml per lever digestiemengsel, samengesteld collagenase / Dispase (0,5 mg / ml), penicilline (100 U / ml) en streptomycine (100 pg / ml) in PBS. Zet Mixture in een 50 ml Falcon buis en incubeer overnacht in een 37 ° C shaker.
- Centrifugeer mengsel bij 400 xg / 3 min / 20 ° C. Giet het overtollige vloeistoffen en vul buis met PBS. Centrifugeer opnieuw en herhaal PBS wassen. Na de laatste centrifugatie, Resuspendeer pellet in 25 ml PBS.
- Zeef de geresuspendeerde pellet via een standaard keuken metalen zeef (gebruik maken van een 50 ml spuit zuiger om mash de lever stukken door in een glazen beker), gevolgd door het passeren van het mengsel door een fijne zeef (gebruik 10 ml spuit om mengsel duwen door de fijne zeef in een tweede bekerglas).
- Doe gespannen mengsel in een 50 ml Falcon buis. Centrifugeer op 400 xg / 5 min / 20 ° C. Giet voorzichtig uit bovenstaande vloeistof zonder verlies van pellet. Resuspendeer de cellen in 3 ml PBS.
- Overlay meng voorzichtig op een 20% Percoll, 40 ml stijgingspercentage van 8 ml en 32 ml Percoll 0,25 M sucrose (FW = 342,3 dus 8,56 g sucrose/100 mL H 2 0).
- Centrifugeer 10 min / 800 xg / 20 ° C. Pipetteer uit eend gooi gelatineuze bovenste laag van de levercellen. Verwijder ei pellet aan de onderkant met een transfer pipet en in een 15 ml Falcon buis.
- Was de pellet 3X in 10 ml PBS / 1 mM EDTA / 1 mM EGTA met centrifuge instellingen: 3 min / 30 XG / 20 ° C. Resuspenderen in 500 ul PBS.
- Overlay mix op een nieuwe 25% Percoll, 10 ml gradiënt (2,5 ml Percoll en 7,5 ml 0,25 M sucrose) met behulp centrifuge instellingen: 10 min / 800 xg / 20 ° C.
- Was 3X in 10 ml PBS met behulp centrifuge instellingen: 3 min / 30 XG / 20 ° C.
- In de laatste 10 ml wassen, verwijder dan 100 ul om eieren te tellen. Eieren snel af te wikkelen, zodat de Falcon buis moet goed gemengd worden alvorens het verwijderen van monster. Verdun het 100 ul monster met 900 ul PBS. 100 pi van het mengsel te worden beschouwd als druppels op een microscoopglaasje met een stereomicroscoop (1:10). Wide-boring pipetpunten te worden gebruikt.
- Resuspenderen eieren op 50.000 eieren / ml in PBS. Eieren kunnen worden opgeslagen gedurende een aantal maanden bij -80 ° C en een of TWIC ontdooide voor gebruik. Inspecteer voor gebruik onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de eieren nog steeds intact zijn (zie Fig. 1).
2. Intraperitoneale Overgevoeligheid met S. mansoni Eieren: dag 0
- Bereid eieren 5000 eggs/100 pi PBS in een 5 ml snapcap buis. Voor injectie, schat 50% meer eieren dan nodig is.
- Laad een 23 gauge 3/4inch naald en een 1 ml spuit met 100 ul van ei suspensie per muis. Eieren af te wikkelen, zodat belasting naald met eieren onmiddellijk vóór gebruik.
- Rock spuit heen en weer om eieren te mengen voorafgaand aan elke injectie, en injecteer intraperitoneaal 100 ul van de schorsing per muis.
3. Retro-orbitale Intraveneuze Challenge met S. mansoni Eieren: Dag 14
- Bereid eieren hierboven op 5.000 eggs/100 pi.
- Verdoven muizen gespecialiseerde kamer met isofluraan (4%) of intraperitoneaal met xylazine (10 mg / kg) en ketamine (120 mg / kg). Diepte van Anesthesia wordt bepaald door knijpen van de voetzool en het waarborgen van geen fysieke reactie.
- Na het laden van de 1 ml spuit en 23 gauge 3/4inch naald met eieren, een tang om de naald te buigen in een hoek van 90 ° met de schuine kant naar beneden in de hoek. Zorg dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
- Plaats muis op een kant. Trek de huid, zodat de ogen zal uitsteken, en injecteer 100 ul in de vaten achter de oogbol in een hoek van 45 ° op de neus.
- Trek de naald en breng lichte druk om het bloeden onder controle.
Al deze procedures worden uitgevoerd zorg en muizen worden gecontroleerd tot ze herstellen anesthesie. Deze protocollen zijn goedgekeurd door de Universiteit van Pennsylvania Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
4. Experimentele Oogst: Dag 22
- Euthanaseren muizen met CO 2.
- Wet muis met 70% ethanol, en de plaats op de rug.
- Met behulp van stompe Forceps, pakt de muis buik en maak een kleine incisie in de huid. Verwijder voorzichtig de huid met een schaar en bloot de ribbenkast en het buikvlies.
- Knip het buikvlies. Snijd de abdominale aorta om het bloed te herstellen met een Pasteur pipet. Sla op het ijs.
- Beweeg de lever naar de membraan bloot. Gebruik fijne schaar om het membraan te snijden. Voorzichtig opengesneden de ribbenkast naar het longweefsel bloot te leggen.
- Herstel de parathymic lymfeklieren dat de long drain met fijne pincet. Deze worden gestopt onder de ribben aan weerszijden van de thymus 9. Store op ijs in 1 ml steriele media (DMEM aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum, 100 U / mL penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 50 pM 2-mercaptoethanol, alle verkrijgbaar bij Invitrogen).
- Om de BAL te herstellen, en blaas de longen voor histologische analyse moet intratracheale intubatie worden uitgevoerd. Expose de luchtpijp door het bewegen van de speekselklieren naar de zijkant, en placing fijn pincet onder de luchtpijp. Met behulp van fijne schaar, knipte een gat in het midden van de luchtpijp, en steek slang in de longen. Zet slang door koppelverkoop met chirurgische draad.
- Bevestig PBS gevulde 1 ml spuit met de slang en pomp longen met 1 ml PBS. Voorzichtig op te halen BAL wassen met een spuit. Sla op het ijs.
- Bevestig 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gevulde 1 ml spuit met de slang en blaas de longen.
- Verwijder de slang en draai de chirurgische draad om te voorkomen dat lekken van de PFA.
- Voorzichtig ontleden van longweefsel en doe dit in een 50 ml Falcon buis met 5 ml 4% PFA.
5. Voorbereiding van de verkregen weefsels
- Serum: Na bewaren op ijs gedurende 30 minuten tot 2 uur voor de bloedstolling, serum wordt gewonnen uit het bloed door centrifugeren (13000 xg / 10 min / 4 ° C). Het serum wordt opgeslagen bij -20 ° C en kan worden gebruikt voor cytokine ELISA of S. mansoni eieren antigeen-specifieke IgG-isotype ELISA's
- Lymfeklieren: enkelvoudige cel suspensies worden bereid en celtellingen gebruikt om de grootte van de immuunrespons te evalueren. Om Th2 cel polarisatie te onderzoeken, worden de cellen opnieuw gestimuleerd met S. mansoni eieren antigeen voor 72 uur. Intracellar cytokine vlekken kunnen worden onderzocht door flowcytometrie en supernatanten kan worden teruggewonnen en opgeslagen bij -20 ° C ELISA van Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) 6.
- BAL: Cellen zijn pellets (400 xg / 5 min / 4 ° C). BAS vloeistof wordt teruggewonnen en opgeslagen bij -20 ° C voor de analyse van Th2 cytokinen door ELISA. BAL-cellen telt worden gebruikt als een indicatie voor de luchtwegontsteking. Cytocentrifuge preparaten van 10.000-100.000 cellen (500 toeren / min 5/4 ° C), zal gevolgd door kleuring Diffquik kunnen opsomming van ontstekingsinfiltraat 4, 6. Als alternatief kunnen BAL-cellen worden onderzocht door middel van flowcytometrie 6.
- Longweefsel: Lung weefsel is opslaged overnacht bij 4 ° C. Vaste weefsel is in paraffine ingebedde, doorsnede en gemonteerd op dia's voor histologische en immunofluorescentie analyse.
6. Representatieve resultaten
Dit protocol staan alle stappen die nodig zijn om (i) het opstellen gezuiverd Schistosoma mansoni eieren voor in vivo gebruik (afb. 1), (ii) te sensibiliseren en uitdagen muizen met deze eieren en (iii) organen te herstellen voor het onderzoek van de longen ontstekingsreactie. Deze in vivo model drijft reproduceerbaar een krachtige Th2 long inflammatoire respons. Dit blijkt uit de luchtwegen ontsteking en eosinofilie als gevisualiseerd door BAL-cellen en cytocentrifuge preparaten (afb. 2). H & E gebeitst longcoupes kan worden gecontroleerd ei-geïnduceerde granulomen (Fig. 3a) en immunofluorescente kleuring van longcoupes maakt visualisatie van alternatief geactiveerde macrofagen en Th2 cytokinen geïnduceerde genen zoals weerstandstin-achtige molecule (RELM) α (Fig. 3b). De antigeen-specifieke CD4 Th2 cytokine reactie wordt gecontroleerd door ELISA voor IL-5, IL-4 en IL-13 antigeen gestimuleerde parathymic lymfeknoopcellen (Fig. 4).
Figuur 1 Schistosoma mansoni ei injectie model vertegenwoordiger foto's van granulomateuze levers, kenmerk van een hoge S.mansoni-ei-lasten, en van S.mansoni eieren worden getoond -.. Gemiddelde grootte (L) 120 micrometer door (W) 50 um.
Figuur 2. S. mansoni ei injectie rijdt luchtwegontsteking. A. BAL celaantallen (x10 5) van naïeve (N) of S.mansoni (Sm) ei-geïnjecteerde muizen. * P <0.05. B. Cytocentrifuge bereiding van BAL cellen. Mac, macrofagen; Eos, eosinofielen, lymfe, lymfocyten. Bar, 10 pm.
Figuur 3. Visualisatie van pulmonaire granulomen en als alternatief geactiveerde macrofagen rondom het S.mansoni ei. A. Pulmonale granuloom rond de Sm ei (zwarte pijl) werd gevisualiseerd in H & E-gekleurde long secties. B. immunofluorescentiekleuring voor RELMα (groen), mannose receptor (rood) en DAPI (blauw) blijkt alternatief geactiveerde macrofagen (witte pijl) in het granuloom rond de autofluorescente Sm ei (zwarte pijl). Bar, 50 pm.
Figuur 4. S.mansoni ei antigeenspecifieke Th2 cytokinereactie. Afvoeren parathymic lymfeknoopcellen van naïeve (N) of Sm ei-geïnjecteerde muizen werden gestimuleerd met Sm </ Em> ei antigeen 72 uur, gevolgd door ELISA van supernatanten van IL-4, IL-5 en IL-13. Schaal, ng / ml. * P <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een model in dienst Schistosoma mansoni eieren van type 2 longontsteking veroorzaken beschreven. Kenmerken van dit model zijn de krachtige Th2 immuunrespons, ontsteking van de luchtwegen en longen granuloomvorming. Aangezien deze parameters afhankelijk van CD4 Th2 celreacties 11 is een nuttig model om de effecten van eiwit-specifieke of lijn-specifieke deleties op Th2 cel respons. Hier is de uitlezingen zou omvatten kwantificering van antigeen-specifieke Th2 cytokines, een analyse van de cel infiltratie in de luchtwegen, en de grootte van de pulmonale granulomen. Een extra parameter die kan worden gemeten is het ei-geïnduceerde fibrose 12. Dit wordt gemeten door kleuring ei-geïnjecteerde longcoupes met Masson's trichroom, die visualisatie van collageen die optreedt rond de vaten de luchtwegen, en binnen de granulomen (in 6) maakt.
Hoewel dit protocolol heeft S. mansoni eieren een beperking van dit model is dat het niet reproduceren S. mansoni infectie, die wordt uitgevoerd door het infecteren van muizen met infectieuze cercariae. Echter, de voordelen van dit model is het gemak voor het opzetten, en dat er geen risico op infectie van de onderzoeker. Na zuivering, kunnen de eieren gemakkelijk worden ingevroren en enkele maanden later gebruikt. Eenmaal ontdooid, de eieren zijn niet besmettelijk, en kan dus gemakkelijker dan levende eieren, of besmettelijke cercariae worden behandeld. Bij de voorbereiding van eieren voor injectie, moet men ervoor zorgen dat eieren intact zijn door de inspectie onder de microscoop. Om ei verstoring, breed-bore pipetpunten en naalden te minimaliseren moeten worden gebruikt bij het werken met, en pipetteren van eieren alleen wanneer dat nodig is. Omdat eieren snel te regelen, is het ook van cruciaal belang voor door zachte schommelen opnieuw te schorsen voor het tellen of injecteren.
Hoewel het gezuiverde eieren kunnen worden bevroren, moet geïnfecteerde levers worden verwerktonmiddellijk voor succesvolle zuivering van eieren. Aangezien de ernst van de infectie en het aantal eieren in de lever muizenstam-afhankelijk de tijdstippen van eieren herstel en ei rendement variëren afhankelijk van de gebruikte muizen. Hier Zwitsers-Webster vrouwtjes dat werd gebruikt, en offerde op 6-7 weken na infectie voor de opwekking van 10,000-30,000 eieren / lever. Als referentiepunt gebruikt, Cheever et al.. detail de lever ei lasten in verschillende muizenstammen 13.
Ei injectie induceert geen sterfte. Echter, muizen bezwijken als over-onder narcose, als het ei preparaat is niet grondig gewassen (zoals beschreven in het protocol), of als ei injectie veroorzaakt ernstige bloedingen. Een alternatief voor retro-orbitale injectie staartader injectie van de eieren. Dit resulteert tevens in een krachtige ei-geïnduceerde long ontstekingsreactie 3. Al deze procedures worden uitgevoerd zorg en muizen worden gecontroleerd tot ze herstellen anesthesie.
Tot slot wordt in dit protocol gegevens injectie van S. mansoni eieren voor de inductie van longontsteking en Th2-cel responsen, en is van toepassing voor de studie van helminth-geïnduceerde ontsteking, astma, allergie en fibrotische ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) AI091759 en de Crohn en Colitis Foundation of America's William en Shelby Modell Family Foundation Research Award (tot MN). Schistosoma-geïnfecteerde muizen werden geleverd door de NIAID schistosome Resource Center (NIAID Contract N01 A130026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase/Dispase | Roche Applied Science | 11 097 113 001 (500mg) | |
| Diff Quik Hema 3 Stain | Pack | Fisher Scientific Co. LLC | 122-911 |
| DMEM | Liquid | Gibco | 11965 |
| Falcon 50mL | Pack | Falcon | 352070 |
| Intramedic PE Tubing | Becton Dickinson and Co. | 427410 (0.58mm) | |
| Isoflurane | Abbot Animal Health | 52600405 (250mL) | |
| Ketamine | Fort Dodge, Animal Health | 100mg/mL | |
| Mannose receptor antibody | Biotin | AbD Serotec | MCA2235B |
| Metallic Strainer | Standard kitchen strainer | Target | Laurentiis |
| Paraformaldehyde | Electron Microsc. Sciences | 15710 (16%) | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | 15070 (100x) | |
| Percoll | GE Healthcare Biosciences | 17 0891 01 (1 Liter) | |
| RELMα antibody | Peprotech | 500-P214 (50μg) | |
| Surgical Thread | Surgical Specialties Corp. | SP118 (2.0 USP 100yds) | |
| Syringe Needle | BD Vacutainer Lab. Med. | 305143 (23g, 3/4 inch) | |
| USA Standard Testing Sieve | W.S. Tyler, Inc. | 150μm, 0.0059" ASTME-11, Spec. No. 100 |
|
| Xylazine | Butler | 20mg/mL |
References
- World Health Organization. Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee. WHO Technical Report Series 912. , Geneva. (2002).
- Pearce, E. J., MacDonald, A. S. The immunobiology of schistosomiasis. Nat. Rev. Immunol. 2, 499-511 (2002).
- Sandler, N. G. Global gene expression profiles during acute pathogen-induced pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and th2 responses in tissue repair. J. Immunol. 171, 3655-3667 (2003).
- Perrigoue, J. G. IL-31-IL-31R interactions negatively regulate type 2 inflammation in the lung. J. Exp. Med. 204, 481-487 (2007).
- Sandor, M., Weinstock, J. V., Wynn, T. A. Granulomas in schistosome and mycobacterial infections: a model of local immune responses. Trends Immunol. 24, 44-52 (2003).
- Nair, M. G. Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung. J. Exp. Med. 206, 937-952 (2009).
- Dalton, J. P. A method for the isolation of schistosome eggs and miracidia free of contaminating host tissues. Parasitology. 115, 29-32 (1997).
- Lewis, F. A. Large-scale laboratory maintenance of Schistosoma mansoni, with observations on three schistosome/snail host combinations. J. Parasitol. 72, 813-829 (1986).
- Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. J. Anat. 109 (Pt. 3), 369-383 (1971).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. Chapter 19, Unit 19 (2001).
- Kaplan, M. H. Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egg-induced granulomatous response. J. Immunol. 160, 1850-1856 (1998).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).
- Cheever, A. W. Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni. Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).
