Summary
Schistosoma ביצים mansoni הם לגירוי חזק מסוג T helper 2 (Th2) בתגובה החיסונית, מאפיין של דלקת טפיל, אסטמה ודלקת אלרגית. פרוטוקול זה מנצל ס mansoni ביצה הזרקת ליצור CD4 תגובה ציטוקינים Th2-Induced דלקת בריאה, המאופיינת היווצרות גרנולומה ריאות סביב הביצה, eosinophilia והפעלה מקרופאג חלופי.
Abstract
טפילים Schistosoma הם תולעים דם להדביק כ 200 מיליון אנשים ברחבי העולם 1. זיהום כרוני עם Schistosoma, פתולוגיה חמורה, לרבות סיסטיק הכבד splenomegaly, נגרמת על ידי התגובה החיסונית את הביצים טפיל ולא הטפיל עצמו 2. ביצי הטפיל לגרום תגובה Th2 מאופיינת בייצור IL-4, IL-5 ו-IL-13, הפעלה חלופית של מקרופאגים ועל גיוס של אאוזינופילים. כאן אנו מתארים זריקת ביצים Schistosoma mansoni כמודל לבחון טפיל ספציפיים תגובות ציטוקינים Th2 בריאה ובלוטות לימפה וניקוז, היווצרות של גרנולומות ריאתי המקיפים את הביצה, ודלקות בדרכי הנשימה.
בעקבות רגישות intraperitoneal ואתגר תוך ורידי, ש ' ביצים mansoni מועברים אל הריאות באמצעות עורקי הריאה שם הם כלואים בתוך parenchyma ריאותגרנולומות על ידי המורכבות של לימפוציטים, אאוזינופילים ומקרופגים מופעל לחילופין 3-6. קשורה להיווצרות דלקת, גרנולומה של broncho-מכתשיים מקומות, הרחבת קשרי הלימפה מסוג CD4 ו מרוקנים הפעלת תא T ניתן לצפות. כאן בפירוט את הפרוטוקול לבידוד Schistosoma ביצים mansoni מ כבדי נגועים (שונה מ 7), רגישות ומאתגרת עכברים, לשחזר את אברי (broncho-מכתשיים שטיפה (BAL), ריאות ובלוטות לימפה וניקוז) לניתוח. אנו גם נציג היסטולוגית ונתונים חיסוניות והצעות חיסוניות ניתוח נוסף.
באופן כללי, שיטה זו מספקת במודל vivo לחקור helminth המושרה תגובות חיסוניות בריאה, שהוא החלים רחב המחקר של מחלות דלקתיות, כולל דלקת Th2 helminth, מחלות fibrotic, דלקת אלרגית ואסטמה. היתרונות של מודל זה לחקר typה 2 דלקת ריאות כוללים שחזור של תגובה דלקתית חזקה Th2 בריאה ובלוטות לימפה וניקוז, להקל על הערכה של דלקת בבדיקה היסטולוגית של גרנולומות המקיפים את הביצה, והוא חסר יכולת אחסון לטווח ארוך של הטפיל ביצים.
Protocol
1. טיהור Schistosoma mansoni ביצים
- להדביק שוויצרי-Webster עכברים עם cercariae schistosome, המהווה את הבמה זיהומיות במחזור החיים Schistosoma 8. לחלופין, לקבל schistosome נגועים עכברים ממשאב NIAID Schistosomiasis מרכז ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). השאירו עכברים 6-7 שבועות לאחר ההדבקה, ועד אז נקודות, ביצים נמצאים בכבד ניתן לשחזר כמפורט להלן (ראו איור 1).
- להרדים עכברים עם CO 2, להרטיב עם אתנול 70%. מניחים על גבי העכבר. השתמש מלקחיים קהים ומספריים לחתוך העור הצפק הבסיסית. הכבד בלו, הממוקמת מתחת בית החזה והסרעפת.
- בשר טחון דק כבדי ולהוסיף 20 מ"ל לכל הכבד של תערובת העיכול, המורכבת collagenase / dispase (0.5 מ"ג / מ"ל), פניצילין (100 U / ml) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ב PBS. שים mixtיור ב צינור פלקון 50 מ"ל ו דגירה לילה 37 ° C שאכר.
- סרכזת התערובת ב 400 דקות XG / 3/20 ° C. בעדינות יוצקים את הנוזל העודף למלא צינורית עם PBS. סרכזת שוב לחזור לשטוף PBS. לאחר צנטריפוגה האחרון, resuspend גלולה ב 25 מ"ל PBS.
- מסננים את גלולה resuspended דרך המטבח הסטנדרטי מתכתי מסננת (שימוש 50 מ"ל במזרק הבוכנה לכתוש את חתיכות כבד אל תוך כוס זכוכית), ולאחר מכן להעביר את התערובת דרך מסננת דקה (להשתמש במזרק 10 מ"ל לדחוף את התערובת דרך מסננת את הקנס לתוך כוס זכוכית 2).
- לשים תערובת מתוחה של צינור פלקון 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 400 XG / 5 דקות / 20 ° C. בזהירות לשפוך את supernatant מבלי לאבד גלולה. Resuspend גלולה ב 3 מ"ל PBS.
- מערבבים בעדינות על שכבת Percoll 20%, 40 מ"ל של צבע 8 מ"ל Percoll ו 32 מ"ל 0.25M סוכרוז (FW = 342.3 אז 8.56 גרם sucrose/100 מ"ל H 2 0).
- סרכזת 10 דקות / XG 800/20 ° C. פיפטה אתד לבטל את השכבה העליונה של דביקות בתאי הכבד. הסר ביצה גלולה בתחתית עם טפטפת העברת להכניס צינור פלקון 15 מ"ל.
- לשטוף גלולה 3X ב 10 מ"ל PBS / 1 mM EDTA / 1 מ"מ EGTA הגדרות באמצעות צנטריפוגות: 3 דקות / 30 XG / 20 ° C. Resuspend ב 500 PBS μL.
- שכבת תערובת על Percoll 25% חדש, 10 מ"ל שיפוע (2.5 מ"ל Percoll ו -7.5 מ"ל 0.25M סוכרוז) באמצעות הגדרות צנטריפוגות: 10 דק '/ 800 XG / 20 ° C.
- לשטוף 3X ב 10 מ"ל PBS באמצעות הגדרות צנטריפוגות: 3 דקות / 30 XG / 20 ° C.
- בשנת לשטוף האחרון 10 מ"ל, 100 μL להסיר לספור ביצים. ביצים ליישב במהירות, כך צינור פלקון חייב להיות מעורב גם לפני הוצאת המדגם. לדלל את מדגם 100 μL עם 900 PBS μL. 100 μL של תערובת יש לספור טיפות על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופ לנתח (01:10 דילול). רחב נשא טיפים פיפטה יש להשתמש.
- Resuspend ביצים על 50,000 ביצים / מ"ל PBS. ביצים ניתן לאחסן במשך מספר חודשים ב -80 ° C, מופשר פעם או twicדואר לשימוש. לפני השימוש, לבדוק תחת מיקרוסקופ על מנת להבטיח כי ביצים הם עדיין שלם (ראה איור. 1).
2. רגישות Intraperitoneal עם ס ' mansoni ביצים: יום: 0
- להכין ביצים על 5000 eggs/100 PBS μL בצינור מ"ל 5 snapcap. להזרקה, מעריכים ביצים 50% יותר ממה שנחוץ.
- טען מחט מד 3/4inch 23 ו מזרק 1 מ"ל עם μL 100 ההשעיה ביצה לכל עכבר. ביצים להתיישב, אז המחט עומס עם ביצים בסמוך לפני השימוש.
- רוק מזרק הלוך ושוב לערבב ביצים לפני כל הזרקה, ולא להזריק 100 intraperitoneally μL של השעיה לכל עכבר.
3. רטרו מסלולית אתגר תוך ורידי עם ס ' mansoni ביצים: יום 14
- להכין ביצים לעיל על μL eggs/100 5000.
- להרדים עכברים בתא מיוחד עם isoflurane (4%), או intraperitoneally עם xylazine (10 מ"ג / ק"ג) קטמין (120 מ"ג / ק"ג). עומק anesthesia נקבע על ידי צביטה של שודד דרכים ולהבטיח שום תגובה פיזית.
- לאחר הטעינה של מזרק 1 מ"ל ו - 23 מחט מד 3/4inch עם ביצים, להשתמש במלקחיים כדי לכופף את המחט בזווית של 90 ° עם שיפוע כלפי מטה לתוך זווית. להבטיח כי בועות לא נוכחים.
- למקם העכבר בצד אחד. לחזור בו העור ולכן העין לא לבלוט, וכן להזרים 100 μL לתוך כלי מאחורי גלגל העין ב 45 מעלות זווית לאף.
- לסגת המחט להפעיל לחץ קל לשלוט בדימום.
כל התהליכים האלה חייבת להיעשות בזהירות ועכברים חייב להיות במעקב עד שהם להתאושש מן ההרדמה. פרוטוקולים אלה אושרו על ידי האוניברסיטה של פנסילבניה בעלי חיים טיפול מוסדי ועדת שימוש (IACUC).
4. קציר הניסוי: 22 יום
- להרדים עכברים עם CO 2.
- העכבר רטוב עם אתנול 70%, ואת המקום על הגב.
- שימוש בוטה forcEPS, לתפוס את הבטן העכבר ולעשות חתך קטן בעור. מוציאים בזהירות את העור עם מספריים ולחשוף את בית החזה ואת הצפק.
- חותכים לפתוח את הצפק. חותכים את אבי העורקים בבטן לשחזר את הדם עם פיפטה פסטר. אחסן על הקרח.
- להעביר את הכבד עד לחשוף את הסרעפת. שימוש במספריים עדינים לחתוך את הסרעפת. בזהירות לחתוך את בית החזה כדי לחשוף את רקמת הריאות.
- שחזור בלוטות הלימפה parathymic המנקזים ריאות עם מלקחיים עדינים. אלה תחוב תחת כלוב הצלעות, משני צדי התימוס 9. חנות על הקרח בתקשורת סטריליים 1mL (DMEM השלימו עם 10% חום מומת סרום עגלים עוברית, 100 U / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, כולם זמינים Invitrogen).
- כדי לשחזר את BAL, ו לנפח את הריאות לניתוח היסטולוגית, אינטובציה intratracheal יש לבצע. לחשוף את קנה הנשימה על ידי העברת בלוטות הרוק בצד, ואת placiמלקחיים עדינים נג תחת קנה הנשימה. שימוש במספריים עדינים, לחתוך חור באמצע קנה הנשימה, והכנס צינור לריאות. לאבטח את צינורות על ידי קשירת חוט כירורגית.
- צרף PBS-מלא 1 מ"ל במזרק כדי צינורות ו לנפח את הריאות עם 1 מ"ל PBS. בזהירות לאחזר לשטוף BAL עם מזרק. אחסן על הקרח.
- צרף paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS מזרק 1 מ"ל כדי למלא צינורות ו לנפח את הריאות.
- הסר את צינורות, ולהדק את החוט כירורגית, כדי למנוע דליפה של PFA.
- בזהירות לנתח את רקמת הריאות ומכניסים 50 מ"ל פלקון צינורית עם 5 מ"ל PFA 4%.
5. אופן ההכנה של רקמות ששוחזרו
- סרום: אחסון הבאה על קרח שעות 30 דקות ל 2 עבור לקרישת הדם, סרום הוא התאושש מן הדם על ידי צנטריפוגה (13,000 XG / 10 דקות / 4 ° C). סרום מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס, ניתן להשתמש ELISAs ציטוקינים או ס mansoni ביצה אנטיגן ספציפי IgG isotype ELISAs
- בלוטות הלימפה: המתלים תא בודד מוכנים וספירת התאים השתמשו כדי להעריך את עוצמת התגובה החיסונית. כדי לבחון את הקיטוב תא Th2, התאים מחדש מגורה עם ס ' mansoni אנטיגן הביצה במשך 72 שעות. מכתים ציטוקינים Intracellar ניתן לבדוק על ידי cytometry הזרימה, supernatants ניתן לשחזר ומאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס במשך ELISA של ציטוקינים Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) 6.
- BAL: תאים הם pelleted (400 XG / 5 דקות / 4 ° C). נוזל BAL הוא התאושש ומאוחסנים ב -20 ° C לניתוח של ציטוקינים Th2 ידי ELISA. של באל ספירת תאים משמשים readout לדלקת דרכי הנשימה. ההכנות Cytocentrifuge של 10,000-100,000 תאים (500 סל"ד / 5 דקות / 4 ° C), ואחריו מכתים Diffquik תאפשר ספירה של דלקת לחדור 4, 6. לחילופין, תאים של באל ניתן לבדוק על ידי cytometry זרימה 6.
- רקמת הריאה: רקמת הריאה היא storאד בן לילה ב 4 ° C. רקמות קבוע הוא פרפין, מוטבע, מחולק רכוב על שקופיות לניתוח היסטולוגית ו immunofluorescence.
6. נציג תוצאות
בפרוטוקול זה פרטים את כל הצעדים הדרושים כדי (א) להכין מטוהרים Schistosoma ביצים mansoni בשימוש עבור vivo (איור 1), (ii) לרגש ולאתגר עכברים עם ביצים אלה (iii) לשחזר איברים לבדיקה של תגובה דלקתית ריאות. זה במודל vivo reproducibly מניע תגובה דלקתית חזקה ריאות Th2. זה מוצג על ידי דלקת דרכי הנשימה ואת eosinophilia כמו דמיינו ידי ספירת תאים של באל ותכשירים cytocentrifuge (איור 2). H & E-מוכתמים סעיפים הריאות ניתן לבדוק את הביצה הנגרמת גרנולומות (איור 3 א), וכן צביעה של חלקים immunofluorescent ריאה מאפשר הדמיה של מקרופאגים מופעל לחילופין ו Th2 ציטוקינים המושרה גנים כגון Resisכמו פח (RELM) מולקולה α (איור 3 ב). אנטיגן ספציפי CD4 בתגובה ציטוקינים Th2 נבדק על ידי ELISAs של IL-5, IL-4 ו IL-13 של אנטיגן, גירוי התאים הצומת parathymic הלימפה (איור 4).
איור 1 Schistosoma mansoni מודל הביצה הזרקת נציג תמונות של כבדי granulomatous, האופייניים S.mansoni, ביצה הנטל גבוהות, של ביצים S.mansoni מוצגים -.. הגודל הממוצע (L) 120 מיקרומטר ידי (W) 50 מיקרומטר.
איור 2. ס הזרקת mansoni ביצה מניע דלקת דרכי הנשימה. א מספרים סלולריים של באל (X10 5) מתוך נאיביות (N) או S.mansoni (SM) ביצה הזריק לעכברים. * P <0.05. ב 'הכנה Cytocentrifuge של תאים ראש. מק, מקרופגים, איוs, eosinophil; הלימפה, הלימפוציטים. בר, 10 מיקרומטר.
איור 3. ויזואליזציה של גרנולומות ריאתי ומקרופגים מופעל לחילופין המקיפים את הביצה S.mansoni. א גרנולומה ריאתי סביב הביצה Sm (שחור חץ) היה דמיינו H & E-מוכתמים סעיפים ריאה. ב 'מכתים immunofluorescence עבור RELMα (ירוק), הקולטן מנוז (אדום) DAPI (כחול) מגלה לחילופין מקרופאגים משופעלים (חץ לבן) גרנולומה סביב autofluorescent Sm ביצה (חץ שחור). בר, 50 מיקרומטר.
איור 4. S.mansoni אנטיגן ספציפי ביצה ציטוקינים בתגובה Th2. ניקוז parathymic קשרי הלימפה תאים בעכברים תמימים (N) או SM ביצים מוזרק היו מגורה עם Sm </ Em> אנטיגן הביצה במשך 72 שעות, ואחריו ELISA של supernatants של IL-4, IL-5 ו-IL-13. קנה מידה, ng / mL. * P <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, מודל העסקת Schistosoma ביצים mansoni לגרום לדלקת ריאות מסוג 2 מתואר. התכונות האופייניות של הדגם הזה כוללות את התגובה החיסונית חזקה Th2, דלקת דרכי הנשימה היווצרות גרנולומה ריאתי. מאז פרמטרים אלה נשענים על תגובות מסוג CD4 סלולריים Th2 11, זהו מודל שימושי כדי לחקור את ההשפעות של מחיקות חלבונים ספציפיים או שושלת ספציפית על תגובות התא Th2. כאן readouts תכלול וכימות של אנטיגן ספציפי ציטוקינים Th2, ניתוח של חדירת תא דרכי הנשימה, והגודל של גרנולומות ריאתי. פרמטר נוסף שניתן למדוד הוא ביצה-Induced סיסטיק 12. זו נמדדת על ידי מכתימה ביצים הזריק חלקים ריאות עם trichrome של מייסון, אשר מאפשר הדמיה של בתצהיר קולגן המתרחשת סביב כלי, דרכי הנשימה, וכן בתוך גרנולומה (מוצג 6).
למרות protocol מעסיקה ס mansoni ביצים, 1 הגבלה של המודל הזה היא שהוא לא לשכפל ס mansoni זיהום, אשר מתבצע על ידי הדבקה של עכברים עם cercariae זיהומיות. עם זאת, היתרונות של מודל זה היא נוחות להקמת, וכי אין סכנה של זיהום של החוקר. לאחר טיהור, הביצים אפשר להקפיא בנוחות בשימוש מספר חודשים מאוחר יותר. מופשר פעם, הביצים אינן זיהומיות, ולכן יכול להיות מטופל בקלות רבה יותר מאשר ביצים חיות, או cercariae זיהומיות. בעת הכנת ביצים להזרקה, יש להבטיח כי ביצים שלמות על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ. כדי למזער את ההפרעה ביצה, רחב נשא טיפים פיפטה ו מחטים יש להשתמש במהלך הטיפול בו, ואת pipetting של ביצים רק בעת הצורך. מאז הביצים ליישב במהירות, הוא גם קריטי מחדש להשעות ידי נדנדה עדין לפני הספירה או הזרקה.
אמנם את הביצים מטוהרים יכול להיות קפוא, כבדי נגועים חייב להיות מעובדמיד לטיהור מוצלח של ביצים. מאז חומרת הזיהום, ומספר הביצים הנמצאים בכבד הם העכבר זן תלוי, בפעם נקודות להתאוששות ביצה ביצה התשואות ישתנו תלוי העכברים שבהם נעשה שימוש. כאן שוויצרי-Webster נשים שימשו, והקריב על 6-7 שבועות לאחר ההדבקה עבור הדור של 10,000-30,000 ביצים / כבד. כהפניה שימושי, שיבר ואח'. פרט את הביצה הנטל הכבד זנים העכבר מספר 13.
זריקת ביצים לא לגרום לתמותה. עם זאת, בעכברים עשוי להיכנע אם יתר בהרדמה, אם הכנת ביצה שלא נשטף היטב (כמפורט בפרוטוקול), או אם הזרקת הביצה גורמת לדימום חמור. חלופה הזרקת רטרו מסלולית הוא הוריד זנב זריקה של הביצים. זה גם התוצאות בתגובה ביצה הנגרמת חזק דלקת ריאות 3. כל התהליכים האלה חייבת להיעשות בזהירות ועכברים חייב להיות במעקב עד שהם להתאושש מן ההרדמה.
לסיכום, פרטים פרוטוקול הזרקת ס ביצים mansoni לזירוז של דלקת ריאות תגובות התא Th2, והוא ישים לחקר helminth-Induced, אלרגיה דלקת, אסטמה ומחלות fibrotic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH) AI091759 ו קרוהן קוליטיס קרן של ויליאם של אמריקה ואת שלבי Modell משפחה פרס קרן מחקר (ל MN). Schistosome נגועים עכברים סופקו על ידי מרכז המשאבים NIAID Schistosome (חוזה NIAID N01 A130026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase/Dispase | Roche Applied Science | 11 097 113 001 (500mg) | |
| Diff Quik Hema 3 Stain | Pack | Fisher Scientific Co. LLC | 122-911 |
| DMEM | Liquid | Gibco | 11965 |
| Falcon 50mL | Pack | Falcon | 352070 |
| Intramedic PE Tubing | Becton Dickinson and Co. | 427410 (0.58mm) | |
| Isoflurane | Abbot Animal Health | 52600405 (250mL) | |
| Ketamine | Fort Dodge, Animal Health | 100mg/mL | |
| Mannose receptor antibody | Biotin | AbD Serotec | MCA2235B |
| Metallic Strainer | Standard kitchen strainer | Target | Laurentiis |
| Paraformaldehyde | Electron Microsc. Sciences | 15710 (16%) | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | 15070 (100x) | |
| Percoll | GE Healthcare Biosciences | 17 0891 01 (1 Liter) | |
| RELMα antibody | Peprotech | 500-P214 (50μg) | |
| Surgical Thread | Surgical Specialties Corp. | SP118 (2.0 USP 100yds) | |
| Syringe Needle | BD Vacutainer Lab. Med. | 305143 (23g, 3/4 inch) | |
| USA Standard Testing Sieve | W.S. Tyler, Inc. | 150μm, 0.0059" ASTME-11, Spec. No. 100 |
|
| Xylazine | Butler | 20mg/mL |
References
- World Health Organization. Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee. WHO Technical Report Series 912. , Geneva. (2002).
- Pearce, E. J., MacDonald, A. S. The immunobiology of schistosomiasis. Nat. Rev. Immunol. 2, 499-511 (2002).
- Sandler, N. G. Global gene expression profiles during acute pathogen-induced pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and th2 responses in tissue repair. J. Immunol. 171, 3655-3667 (2003).
- Perrigoue, J. G. IL-31-IL-31R interactions negatively regulate type 2 inflammation in the lung. J. Exp. Med. 204, 481-487 (2007).
- Sandor, M., Weinstock, J. V., Wynn, T. A. Granulomas in schistosome and mycobacterial infections: a model of local immune responses. Trends Immunol. 24, 44-52 (2003).
- Nair, M. G. Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung. J. Exp. Med. 206, 937-952 (2009).
- Dalton, J. P. A method for the isolation of schistosome eggs and miracidia free of contaminating host tissues. Parasitology. 115, 29-32 (1997).
- Lewis, F. A. Large-scale laboratory maintenance of Schistosoma mansoni, with observations on three schistosome/snail host combinations. J. Parasitol. 72, 813-829 (1986).
- Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. J. Anat. 109 (Pt. 3), 369-383 (1971).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. Chapter 19, Unit 19 (2001).
- Kaplan, M. H. Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egg-induced granulomatous response. J. Immunol. 160, 1850-1856 (1998).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).
- Cheever, A. W. Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni. Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).
