Summary
Questo protocollo video dimostra l'applicazione del colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE) per l'identificazione e la separazione di differenti sottopopolazioni di cellule di glioblastoma umano basati sulla frequenza di divisione cellulare.
Abstract
Eterogeneità tumorale rappresenta una caratteristica fondamentale di supporto robustezza tumore e presenta un ostacolo centrale per lo sviluppo di strategie terapeutiche 1. Per superare il problema della eterogeneità tumorale, è essenziale sviluppare saggi e strumenti che consentono fenotipica, (epi) identificazione genetica e funzionale e caratterizzazione di sottopopolazioni tumorali che guidano patologie malattie specifiche e rappresentano obiettivi clinicamente rilevanti. È ormai noto che i tumori esporre distinti sotto-frazioni di cellule con differenti frequenze di divisione cellulare, e che i criteri funzionali essendo ciclo lento è correlata positivamente con capacità di formazione di tumori in diversi tumori inclusi quelli del cervello, la mammella, della pelle e pancreas così come la leucemia 2-8. Il colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE) è stato utilizzato per il monitoraggio della frequenza di divisione delle cellule in vitro e in vivo in ematica tumors e tumori solidi come il glioblastoma 2,7,8. La cellula-permeant non fluorescente pro-farmaco di CFSE viene convertito da esterasi intracellulari in un composto fluorescente, che è trattenuta all'interno delle cellule da covalentemente legame alle proteine per reazione della sua porzione succinimidil con gruppi amminici intracellulari di formare legami ammidici stabili 9. Il colorante fluorescente è equamente distribuito tra cellule figlie upon divisioni, portando alla dimezzamento dell'intensità di fluorescenza con ogni divisione cellulare. Ciò consente il monitoraggio della frequenza del ciclo cellulare fino a otto-dieci giri di divisione 10. Capacità di ritenzione CFSE è stato utilizzato con le cellule tumorali del cervello per identificare e isolare una sottopopolazione lento in bicicletta (top 5% dye-fissaggio celle) ha dimostrato di essere arricchito in attività delle cellule staminali del cancro 2.
Questo protocollo descrive la tecnica di colorazione delle cellule con CFSE e l'isolamento di singole popolazioni in una cultura umana glioblastoma (GBM) derivati da cellule che posseggono differenti tassi di divisione in citometria a flusso 2. La tecnica è servito per identificare e isolare un tumore lento ciclismo popolazione di cellule cerebrali in virtù della loro capacità di trattenere l'etichettatura CFSE.
Protocol
1. Preparazione sospensione singola cella Glioblastoma
- Cultura Gliomasphere è stabilito e mantenuto con il dosaggio neurosfere (NSA), come descritto in precedenza 2,11,12.
- Al momento opportuno per passaging le gliomaspheres, il terreno contenente le sfere viene rimosso, collocato in un apposito tubo di tessuto sterile cultura dimensioni, e centrifugati a 800 rpm (110 g) per 5 min a temperatura ambiente.
- Il supernatante viene scartato e il pellet di sfere viene risospeso in 1 ml di 0,05% tripsina-EDTA e incubate a 37 ° C in un bagno di acqua per 3-5 min.
- Un volume uguale di inibitore della tripsina di soia viene poi utilizzato per interrompere l'attività tripsina.
- La sospensione cellulare viene delicatamente pipettato su e giù per assicurare omogeneità e neutralizzazione completa dell'attività tripsina.
- La sospensione cellulare viene nuovamente centrifugata a 800 rpm per 5 min. Il supernatante viene rimosso e le cellule sono risospese in 1 ml di NeuroCultNSC medio basale.
- 10μl della cella singola sospensione viene miscelata con 90μl di trypan blu per eseguire una conta cellulare.
2. La colorazione con cellulare Trace Carboxyfluorescein succinimidile Ester (CFSE) Dye Green Fluorescent
- Per ogni 1 milione di cellule da colorare, 1 ml di reagente di colorazione viene preparata aggiungendo 1 ml di colorante 5 Cella CFSE mM Trace (Molecular Probes, Invitrogen) a 1 ml di terreno NeuroCult NSC Basal per dare una concentrazione finale di 5 mM colorazione .
- Il reagente di colorazione contenente le cellule è mescolata bene fino omogeneità e incubate a temperatura ambiente per 10 min.
- Durante l'incubazione, gelida NeuroCult Medio NSC Basal viene preparata come la soluzione quenching.
- Per interrompere il processo di colorazione, circa 5-10 volumi di soluzione ghiacciata quenching viene aggiunto ai CFSE-caricati cellule.
- La soluzione viene quindi centrifugata a 800 rpm per 5 minuti e il supernatante viene scartato.
- A °è punto, dovrebbe apparire un pellet di cellule sul fondo del tubo con un verde brillante tinta del colore, che indica la colorazione era successo.
- Le cellule vengono lavate risospendendo il pellet in 1-2 ml di fresca Medio NeuroCult NSC Basal, centrifugazione a 800 rpm per 5 min e scartando il supernatante. Questa procedura viene ripetuta per un totale di tre lavaggi.
- Dopo il terzo lavaggio, le cellule sono risospese in 1 ml di terreno NeuroCult NSC Basal e una conta cellulare viene eseguita.
- Le cellule vengono quindi colorate CFSE piastrate in palloni di coltura tissutale sterili alla densità adeguata [50.000 cellule / ml] e posto a 37 ° C / 5% CO2 incubatore umidificato.
3. CFSE Caricamento di verifica
- Le cellule in coltura placcati NSA può essere monitorato con un microscopio a fluorescenza per verificare la colorazione CFSE. In questa fase, tutte le cellule mostrano colore verde brillante (Figura 1). In alternativa, una goccia di sospensione cellulare daCellule colorate CFSE potrebbe essere posto su un vetrino e coperto con vetrino di visualizzare le cellule al microscopio a fluorescenza.
- Etichettatura CFSE successo è ulteriormente confermato tramite citometria a flusso. Fino a 1-5 x 10 5 cellule da ciascun gruppo è sufficiente per la verifica CFSE colorazione. Il CFSE cellule caricate e scaricate cellule di controllo negativo sono rispettivamente risospese in 1 x PBS-o NeuroCult Medio NSC Basal per un volume totale di 500 microlitri e posta in tubi separati FACS.
- La citometria a flusso è regolato in base alle istruzioni per l'uso i manuali per i relativi parametri. CFSE ha un massimo di eccitazione lunghezza d'onda di 492 nm e un massimo di emissione di 517 nm.
- Primo, le cellule di controllo scarichi vengono eseguiti e gli eventi acquisiti vengono registrati in scatter in avanti e laterale (FSC e SSC) e trame istogramma, e la popolazione cellulare principale è gated (Figura 2A).
- Analogamente, le cellule CFSE caricati vengono analizzati utilizzando lo stesso parametros usato per cellule di controllo (Figura 2B).
4. Isolamento del Slow-dividendo [CFSE cioè di fissaggio] popolazione di cellule Uso fluorescente Ordinamento attivato cellulare (FACS)
- Sulla divisione, CFSE intensità diminuisce e cellule hGBM formare gliomaspheres che sono composti da cellule che presentano diversi livelli di intensità di fluorescenza verde (Figura 3). Quando i gliomaspheres hanno raggiunto una dimensione media di circa 150-200 micron di diametro (circa 5 a 10 giorni dopo carico CFSE seconda del tasso di crescita della linea cellulare), il terreno contenente le sfere viene rimosso, collocato in una dimensione appropriata coltura tissutale sterili tubo, e centrifugati a 800 rpm per 5 min a temperatura ambiente.
- Una cella singola sospensione è preparata come descritto nei passaggi precedenti e le cellule sono risospese in PBS per una conta cellulare al fine di preparare una sospensione cellulare con una densità fino a 10 7 cellule per millilitro.
- A poppaer risospendere le cellule in un volume appropriato di PBS, ioduro di propidio (PI, Sigma, 500 mg / ml) viene aggiunto ad una concentrazione di 1 pl / ml di sospensione cellulare per escludere cellule morte quando ordinati / analizzate al citofluorimetro.
- Due 15 ml provette sterili di coltura di tessuti contenenti ciascuno 1 ml di completo Medio NeuroCult NSC viene utilizzato per raccogliere le cellule selezionate lento divisione (cellule CFSE di sostegno) e le cellule veloci divisione (cellule CFSE diluizione).
- In primo luogo, la sospensione di cellule dal gruppo di cellule scarico viene fatto passare attraverso il citofluorimetro.
- Le cellule (eventi) vengono riportati sulla base forward scatter (FSC) rispetto side scatter (SSC) e parametri di tensione per entrambi i parametri vengono regolati in modo che la maggior parte delle cellule sono incluse nel diagramma di flusso.
- Per escludere le cellule morte o danneggiate, le cellule vengono tracciati sulla base di reattività SSC rispetto PI e la singola popolazione cellulare in tempo reale (PI negativo) è sorvegliato.
- Poi, una popolazione cellulare omogenea viene selezionato in base forward scatter (FSC) rispetto side scatter (SSC).
- La popolazione omogenea di cellule singole vivo viene tracciata in un istogramma basata sulla frequenza cella rispetto intensità CFSE impostato su una scala logaritmica. L'intensità del laser CFSE viene regolata in modo da mettere il segnale negativo tra 0 e 100.
- Usando gli stessi parametri e di una strategia di gating simile, le cellule CFSE etichettati vengono eseguiti attraverso il citofluorimetro e analizzati (Figura 4C).
- Successivamente, una popolazione lenta divisione di cellule e una popolazione complessiva (più veloci le cellule in divisione) sono identificati in base alla loro capacità di trattenere CFSE (CFSE high-top 5% e CFSE basso bottom 85%, rispettivamente).
- Queste diverse popolazioni cellulari sono poi suddivisi in separati 15 provette sterili di coltura dei tessuti ml contenenti 1 ml di completo supporto NSC.
- Cellule filtrate vengono quindi centrifugati a 800 rpm per 5 min.
- Il supernatante viene scartato e il pellet viene risospeso in un idoneotuno volumi di mezzo (a seconda del numero di eventi isolati o dimensioni pellet) e una conta cellulare viene eseguita.
- Cellule da diverse popolazioni filtrate vengono piastrate a 50.000 cellule per ml in un matraccio di coltura tissutale appropriate sterile e posto a 37 ° C / 5% CO2 incubatore umidificato per 5-10 giorni prima di essere serialmente diversi passaggi o utilizzato per esperimenti a valle.
5. Risultati rappresentativi
Dopo il caricamento CFSE, tutte le cellule presenti un'intensa fluorescenza verde come visualizzato al microscopio (Figura 1). Questo verdastro colore può essere visto anche ad occhio nudo (vedi il video). Analizzare queste cellule con citometria di flusso mostra anche altamente fluorescenza verde intenso rispetto a cellule di controllo (Figura 2). Su cellule CFSE placcatura caricati nella cultura neurosfere, queste cellule proliferano e formano 150-200 micron gliomaspheres in 5-10 giorni. Come le cellule proliferano, t colorante fluorescente che è equamente distribuito tra cellule figlie su divisioni, portando alla dimezzamento dell'intensità di fluorescenza di ogni divisione cellulare. Glioblastomi sono funzionalmente eterogenei e sono composti da cellule proliferanti su diverse scale temporali. Il metodo descritto in questo protocollo permette di identificare e isolare cellule in divisione rapida e lenta in virtù della loro capacità di diluire o mantenere CFSE, rispettivamente (figura 3, anche il video).
Citometria di flusso dell'analisi gliomaspheres dissociate generati da cellule CFSE-caricati in confronto alle cellule scariche dimostra diverse proprietà di ritenzione CFSE (Figura 4). Veloce cellule in divisione (in basso 85%) o lento (cellule che si dividono i primi 5% - CFSE alto) gliomapshere mostra la formazione di abilità quando coltivate in condizioni di saggio neurosfere (Figura 5).
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Figura 1. Cellule tumorali dissociati subito dopo il caricamento con la tintura CFSE. Le cellule presentano colore verde brillante dimostrando etichettatura di successo. Originale ingrandimento, 10 x.
Figura 2. Loading conferma CFSE in citometria a flusso. A) cellule scaricato, B) CFSE caricato cellule e C) Confronto tra intensità di fluorescenza CFSE in cellule cariche rispetto a vuoto. Si noti che vi è di diversi ordini di grandezza differenza nell'intensità di fluorescenza tra le cellule marcate e non marcato.
Figura 3. A gliomasphere rappresentante derivata da un CFSE caricato a cella 6 giorni dopo placcatura. Alcune cellule presentano una colorazione CFSE molto luminoso. Originale ingrandimento, 63 x.
Figura 4. Rappresentante citometria a flusso trame / istogrammi per l'isolamento di cellule in divisione veloci e lente 6 giorni dopo la colorazione CFSE. A) FSC e SSC per mostrare tutta la popolazione cellulare, B) reattività SSC vs PI di escludere le cellule morte o danneggiate, C) FSC e SSC a cancello una popolazione omogenea cellule vive, D) dimostra la presenza di cellule CFSE ritegno 6 giorni dopo etichettatura CFSE come evidenziato da una maggiore intensità di fluorescenza rispetto al controllo negativo. L'istogramma mostra anche che l'intensità CFSE decaduto nel tempo. E) Istogramma visualizzazione della strategia di gating per identificare cellule CFSE fissaggio (top 5%) e cellule CFSE diluenti (bottom 85%).
Gliomaspheres rappresentativi Figura 5. Generati da
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Discussion
Un numero crescente di studi hanno dimostrato l'importanza di una lenta separazione sub-compartimento di cellule nel cancro che contribuiscono alla formazione di tumori e di resistenza al trattamento 2-8. Pertanto è fondamentale per descrivere e standardizzare metodi sperimentali che consentano lo studio di questa sottopopolazione di cellule o più in generale per confrontare sottopopolazioni con differenti tassi di crescita. Utilizzando CFSE per identificare e isolare sotto-frazioni di cellule in base al loro tasso di divisione cellulare è un punto di partenza per caratterizzare ulteriormente queste frazioni cellulari specifici, contribuendo a migliorare la nostra comprensione della eterogeneità descritto nei tumori. In questo protocollo abbiamo dato l'esempio di identificare e isolare una lenta separazione popolazione all'interno glioblastoma, ma questo protocollo può essere applicato anche ad altre cellule tumorali, compresi e non limitati a tumori della mammella, del pancreas e della pelle. L'analisi a valle di queste popolazioni può essere eseguito e può includere funzstudi ional confronto potenziale proliferativo 2, capacità formazione di tumori 2, la sensibilità del trattamento, e (epi) confronti genetici. Questo metodo può essere utilizzato anche con sistemi non-cancerose e può essere applicato, per esempio, a somatiche staminali / precursori.
Punti critici tecnici coinvolti nel procedimento dissociazione adeguato di cellule con tripsina, e risospensione sufficiente di cellule nei mezzi di colorazione per stabilire una giusta densità e garantire colorazione omogenea. Un piccolo campione di cellule colorate freschi deve essere controllata mediante citometria a flusso per garantire l'etichettatura omogenea caratterizzata da una gaussiana come profilo stretto (vedi Figura 2B). Nel caso di etichettatura eterogenea iniziale, un pre-ordinamento può essere eseguito in modo da migliorare la risoluzione di picco con ristretta gamma di fluorescenza CFSE. Tuttavia si deve garantire che questa pre-tipo non seleziona per dimensioni specifiche. L'utilizzo di ioduro di propidio (PI) etichettatura i èmportante per identificare cellule vive e morte / rimozione popolazione danneggiata dal cancello di lavoro, a causa della distorsione che cellule morte può introdurre nelle applicazioni a valle. Vale la pena notare l'intensità particolarmente elevata fluorescenza dell'etichettatura CFSE e il suo potenziale di sanguinare in altri canali utilizzando fluorocromi vicini nello spettro, come il fluorocromo ficoeritrina (PE). E 'fondamentale notare che gli esperimenti multiplex etichettatura con CFSE e coniugato a un fluorocromo anticorpi può richiedere un processo di compensazione al momento di acquisizione o di analisi. Siate sicuri di avere tutti i controlli necessari che includono le cellule non marcate (che fornisce il livello di autofluorescenza), isolati cellule colorate e la combinazione specifica. Più colori etichettatura in combinazione con CFSE funziona meglio con fluorocromi come Pacific Blue o alloficocianina (APC). Se lo scopo dell'esperimento è di quantificare il numero assoluto di divisioni cellulari in un periodo di tempo definito, il CFSE intensità media di fluorescenza (MFI) deve essere misurata a un minimo di due tempi diversi punti 2 con la prima almeno 24 ore dopo carico CFSE. Intensità CFSE cade drasticamente entro le prime 24 ore, in assenza di divisione cellulare, ma poi si stabilizza e diminuisce in relazione alla divisione cellulare. È inoltre necessario includere un controllo con cellule non proliferative CFSE caricati forniscono la base per decadimento CFSE intensità non correlate a divisione cellulare.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro per la Ricerca Florida Tumore al cervello, il Preston A. Wells Jr. Centro per la Terapia Tumore al cervello e il National Institutes of Health (1R21CA141020-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | R&D Systems | 2028-EG | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Molecular Probes, Life Technologies | C34554 |
References
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