Summary
Total reflexão interna de fluorescência microscopia (TIRF) é uma abordagem poderosa para observar as estruturas perto da superfície da célula em alto contraste e resolução temporal. Demonstramos como TIRF pode ser empregue para estudar a dinâmica de proteína no córtex de parede celular fechados células bacterianas e fúngicas.
Abstract
Microscopia TIRF emergiu como uma tecnologia de imagem poderosa para estudar espácio-temporais dinâmica de moléculas fluorescentes in vitro e em células vivas 1. O fenómeno óptico de reflexão interna total ocorre quando a luz passa de um meio com elevado índice de refracção em um meio com baixo índice de refracção com um ângulo maior do que um ângulo característica crítica (isto é, mais perto de ser paralelo com o limite). Embora toda a luz é reflectida de volta sob tais condições, uma onda evanescente é criado que se propaga através e ao longo do limite, que decai exponencialmente com a distância, e só penetra áreas de amostra que são 100-200 nm perto da interface 2. Além de proporcionar resolução axial superior, a excitação reduzida de fora do foco fluoróforos cria um sinal muito alta para relações de ruído e minimiza os efeitos prejudiciais da fotodegradação 2,3. Sendo uma técnica de campo amplo, TIRF também permite que imagem mais rápido acquisition do que a maioria de digitalização baseados em configurações confocal.
À primeira vista, a profundidade de penetração baixa de TIRF parece ser incompatível com a imagem de células bacterianas e fúngicas, que são muitas vezes cercados por paredes celulares espessas. Pelo contrário, verificou-se que as paredes celulares de levedura e células bacterianas realmente melhorar a usabilidade do TIRF e aumentar a gama de estruturas observáveis 4-8. Muitos processos celulares podem ser acessados diretamente pelo TIRF em pequenos microorganismos unicelulares, que muitas vezes oferecem poderosas técnicas de manipulação genética. Isso nos permite executar em experimentos de bioquímica in vivo, onde cinética de interações protéicas e atividades podem ser avaliados diretamente em células vivas.
Descrevemos aqui os passos individuais necessárias para obter imagens de alta qualidade para TIRF Saccharomyces cerevisiae ou células de Bacillus subtilis. Ressalte-se vários problemas que podem Affect visualização TIRF de sondas fluorescentes em células e ilustram o procedimento com vários exemplos de aplicação. Por fim, demonstramos como as imagens TIRF pode ser melhorada usando técnicas de restauração de imagem estabelecidos.
Protocol
1. Preparação da Amostra
- Preparando lamínulas
Lamelas devem ser limpos a partir de partículas de pó como TIRF é sensível a sinais de fundo resultantes da lamela (Fig. 1A, Filme 1).- Usando fórceps lamínulas lugar em um suporte de cerâmica com tampa.
- Encha recipiente de vidro com 1 M NaOH (pode ser reutilizado várias vezes).
- Incubar durante 2 h sob rotação contínua lenta (agitador orbital). Incubação excessiva (> 8 h) criará lamínulas opacos.
- Lavar duas vezes com água destilada durante 5 min sob rotação contínua lenta.
- Armazenar na titular cerâmica coberta em etanol a 100%.
- Preparação de células de Bacillus subtilis
- Diluir a uma OD de 600 0,01-0,05 em 5 ml de meio de crescimento apropriadas e crescer a fase exponencial (DO600 de 0,3-0,7).
- Preparar 1,25% de agarose em água ou médio. Use a mídia sintéticos para reduzir a fluorescência de fundo. Dissolver o pó num tubo de 1,5 ml de plástico a 95 ° C e armazenar em bloco de aquecimento a 72 ° C.
- Adicionar uma pequena gota de agarose para o meio de uma corrediça e prima em uma superfície plana com um segundo slide. Cuidadosamente lâminas separadas após, pelo menos, 2 min ou antes de usar.
- Girar 500 células ul em micro centrífuga a 12,000 rpm por 1 min.
- Elimine o sobrenadante, e ressuspender o pellet em 50 uL médio.
- Adicionar 2-4 células uL para o centro da almofada de agarose.
- Tomar uma lamela limpo a partir do recipiente cheio de etanol com uma pinça, seco com ar pressurizado e colocar cuidadosamente na amostra.
- Deixe células para resolver, pelo menos, 2 minutos antes da microscopia.
- Selar bordas da lamínula com VALAP (vaselina, lanolina e parafina, misturada com peso igual sob o calor, aplicar com um pincel pequeno ou cuspiuula) para geração de imagens de longo prazo.
- Preparação células de Saccharomyces cerevisiae
- Diluir pré-cultura e crescer em meios apropriados, pelo menos, 5 h à fase exponencial (DO600 0,2-0,8).
- Tomar uma lamela a partir do recipiente com uma pinça e secos com ar pressurizado.
- Espalhe 5 uL Concanavalina A solução (ConA, 2 ug / ml em água destilada) em lamela com uma pipeta e seco com ar pressurizado. ConA se liga aos hidratos de carbono da parede da célula de levedura e imobiliza células de levedura.
- Transferir 4,5 suspensão de células de levedura uL para um lado da lamela ConA-revestido. Com cuidado, coloque lamínula em lâmina de microscópio. Começar com uma borda e deixar cair lentamente para evitar a formação de bolhas de ar.
- Deixe células para resolver, pelo menos, 2 minutos antes da microscopia.
- Bordas Selo de lamela com VALAP (ver acima) para geração de imagens a longo prazo.
- Configuração do microscópio
Nós realizamos todos os experimentos em uma configuração TIRF personalizado baseado em um estande IMIC totalmente automatizado (Till Photonics) com um 100x Olympus objetivo NA 1,45. 75 lasers DPSS mW a 488 nm (safira coerente) e 561 nm (Cobolt Jive) foram utilizados como fontes de luz. Lasers foram selecionados através de um AOTF e dirigido através de uma fibra de banda larga para o IMIC. Um galvanômetro-driven cabeça do scanner de dois eixos foi utilizado para ajustar os ângulos de incidência ou de recuperação de fluorescência após Fotodegradação (FRAP) posição. Um galvanômetro adicional foi usado para alternar entre epifluorescência, FRAP e TIRF. As imagens foram recolhidas com um DU-897 ixon Andor câmara EMCCD e uma lente de ampliação 2x em frente da câmara. Aquisição foi controlado pelo Aquisição Live (Até Photonics) pacote de software.
Os seguintes pontos devem ser considerados:- Controle programável por fonte de iluminação (laser line) e TIRF ângulo é essencial para obter resultados reprodutíveis e, especialmente, para a multi-cor TIRF, onde os ângulos de incidência necessitar de ser ajustada para cada comprimento de onda de excitação para assegurar uma penetração igual de ondas evanescentes. No nosso ângulo configuração TIRF pode ser ajustado instantaneamente através de dois galvanómetros, que são controladas directamente a partir do pacote vivo aquisição de software.
- Nossa configuração personalizada, além disso permite a comutação rápida entre epifluorescência, TIRF e FRAP através de um galvanômetro terceiro, permitindo a medição simples da cinética de localização para rastrear objetos em TIRF.
- Objetivo tipo TIRF requer altas aberturas numéricas de NA> 1,4. Foi utilizada uma 100x Olympus NA 1,45 objectivo.
- EMMCD câmeras funcionam muito bem com TIRF devido à sua alta relação sinal-ruído. Para permitir que imagiologia com sensibilidade óptima foi utilizado um pixel de 512x512 iluminação traseira da câmara EMCCD com um tamanho de pixel de 16 uM. Para manter a resolução máxima que colocou uma magn 2xlente ificação em frente da câmara.
- Como TIRF é uma técnica de campo amplo, a intensidade de raios laser é espalhada para fora. Lasers de alta potência, portanto, muitas vezes melhorar a imagem. Foram utilizados 75 mW bombeado diodo de estado sólido (DPSS) lasers a 488 nm e 561 nm.
- Para manter as células em condições ideais de crescimento durante o exame, use os controles ambientais apropriados. Utilizou-se uma câmara de aquecimento feitos (Fig. 1B) para estudar os mutantes de levedura sensíveis à temperatura. Para troca de meio durante a aquisição, ou utilizaram câmaras de fluxo simples ou pratos com fundo de vidro de cultura que podem ser facilmente acessados a partir de cima no microscópio invertido.
- Ajustando os parâmetros
- Identificar a posição das células usando iluminação de campo claro. LEDs vermelhos são particularmente bons em que não induzir danos foto significativa.
- Mudar para a iluminação a laser e selecione lasers apropriados e combinações de filtro para excitar os fluoróforos deescolha. Certifique-se que o ângulo TIRF é subcrítico, ou você não será capaz de detectar qualquer sinal decorrente de proteínas de fusão GFP. Em caso de dúvida ajustar o ângulo TIRF a 0 ° para se obter um feixe de laser perpendicular. Encontrar a secção superior da célula (lado da célula de frente para a lamela). Alterar o ângulo de incidência do feixe de laser até desaparecer sinais, em seguida, lentamente aumentar o ângulo até o ponto onde a fluorescência com os reaparece de superfície celular (Filme 2). Ajuste z-foco novamente para a posição ideal na superfície. Ângulos aceitáveis TIRF criar nenhuma auréola turva na borda da célula (Fig. 1C). Se foto significativa branqueamento ocorre durante a instalação, salve o ângulo TIRF e mover para uma posição estágio crus antes de iniciar a aquisição.
- Ajuste intensidades de laser e câmera de ganho para maximizar o alcance dinâmico (alta relação sinal-ruído sem saturar pixels). Normalmente as câmeras EMCCD são ideais para detectar sinais muito baixos em sinal de alta para rato ruídoios. Para sinais mais fortes câmeras CCD regulares produzem menos ruído e oferecer uma maior gama dinâmica.
- Microscopia TIRF é muito sensível a pequenas diferenças de altura da lamela, resultando em células apenas poucas, o que pode ser trabalhada, ao mesmo tempo (Figura 1D). Para as células pequenas a região de aquisição (região de interesse, ROI) pode, portanto, muitas vezes, ser reduzida para uma sub-região que contém o objecto de escolha. Isto também reduz o tempo necessário para transferir os dados do chip para a unidade de disco rígido, muitas vezes o passo limitante da velocidade na altas taxas de quadros.
- Para a cor dupla experimentos TIRF certifique-se de minimizar o sangramento através de fluoróforos. Para RFP / GFP pares de usar filtros de emissão separados como RFP é fracamente excitados por luz 488 nm (Fig. 2A). A maioria dos filtros não são perfeitamente alinhados uns com os outros. Filtrar offset pode ser corrigido usando esferas fluorescentes misturadas com as células. Para alcançar a profundidade de penetração comparável, ajustar ângulos TIRF separadamente for cada linha laser. Um fluxo de trabalho típica é ilustrada na fig. 2B.
- Um parâmetro crítico que influencia a qualidade da imagem é o alinhamento a laser e um objetivo limpo. Para alinhar o laser foco, primeiro sobre a posição z utilizado para TIRF de imagem. Em seguida, remover a amostra e limpar o objectivo de todo o petróleo (óleo residual conduzirá a difracção da luz laser e os salpicos no perfil do feixe). Projetar o laser no teto no modo TIRF e calibrar a posição de 0 ° de tal forma que o laser é em linha reta com o objetivo (use ponto de referência, sempre use óculos de segurança a laser e evitar todas as reflexões no caminho do feixe). Focar o ponto de laser para um tamanho mínimo. Nossa configuração proporciona uma lente móvel posicionado entre galvos e microscópio a fim de facilitar a calibração rápida. Após o ajuste ideal, o perfil do laser deve formar um bem definir local com forma aproximadamente redonda. Executar a calibração antes de cada sessão para obter melhor qualidade de imagem.
3. Os resultados representativos
- Distribuição de homólogos de actina e de enzimas da parede celular em Bacillus subtilis. Nós imaged células expressando fusões GFP do homólogo de actina Mbl ou o PbpH transpeptidase por TIRF e epifluorescência regular. A profundidade de penetração no TIRF é claramente reduzida e limitada à superfície de frente para a lamela (Fig. 3A, B). O PbpH transpeptidase fracamente expresso localiza a patches corticais que são dificilmente visível por epifluorescência mas pode distinguir-se claramente TIRF (Fig. 3B). A penetração reduzida pode ser melhor observado para PbpHGFP sinal em septos, que aparecem como linhas em epifluorescência mas como pontos em TIRF (Fig. 3B, seta).
- Domínios de proteína na membrana plasmática de levedura. Exemplos de rede, como padrões formados por proteínas de membrana de plasma em levedura são já dado na fig. 1C e2. Além do contraste melhorado em TIRF que permite distinção clara destes padrões de rede semelhantes, os sinais fracos pode por vezes ser detectada exclusivamente por microscopia TIRF. Como exemplo, trabalhada uma fusão GFP do Bit61 componente TORC2 complexo a partir de Saccharomyces cerevisiae. Esta proteína é fracamente expressa e forma pequenas manchas corticais com cópias de proteína poucos por patch 9. Em epifluorescência apenas poucas manchas são visíveis acima do fundo forte, enquanto remendos podem ser trabalhada com o sinal de muito boa para relação de ruído em TIRF (Fig. 3C). Portanto TIRF é particularmente bem adequado para estudar as estruturas fracamente fluorescentes e proteínas na superfície celular. A resolução axial elevado fornecido por TIRF já reduz a fluorescência de fundo. Melhoria adicional do contraste da imagem pode ser obtido através de vários passos de processamento de imagem. Uma técnica simples padrão é de equalização de fundo local onde uma imagem desfocada é subtraído dooriginal. Desfocagem pode ser realizada com uma variedade de filtros passa baixo, incluindo filtros medianos ou Gaussian (Fig. 3D). Local subtração de fundo remove o ruído e aguça estruturas de alta intensidade. No entanto, isso muitas vezes vem com o preço de uma perda de estruturas finas e amplificação exagerada de regiões de alta intensidade (Fig. 3D, seta). Um procedimento superior é desconvolução 2D, que pode ser realizada com pacotes de software livre ou comercialmente disponíveis, tais como ImageJ, Matlab ou Huygens (Scientific Volume de imagem bv). Imagens TIRF fornecer muito boa resolução axial e, portanto, uma função de dispersão quase bidimensional ponto (PSF). Nós determinado experimentalmente este PSF através da aquisição de imagens de 40 nm grânulos fluorescentes com as mesmas configurações que foram usadas para a imagem real (objetivo, câmera de excitação, e comprimento de onda de emissão) O PSF experimental foi então utilizado para deconvolução com um algoritmo clássico da máxima verossimilhança em Huygens. Tempocaducar filmes de GFPRas2 ou de Fet3GFP e Pma1RFP (Filmes 3 e 4) demonstram o aumento de contraste após deconvolução. Em imagens a cores duplas é crítico para maximizar o contraste, para ser capaz de quantificar valores colocalização (Filme 4).
- Análise de turnover de proteína no córtex célula. TIRF e FRAP oferecer uma combinação poderosa para o estudo da dinâmica de proteínas corticais. No entanto, para permitir a utilização eficiente destas técnicas, o controlo rápido de ângulos de laser e posições é necessária. Em TIRF, uma técnica de amplo campo, o laser tem de ser focada no plano focal posterior e deve seguir um ângulo de incidência raso para atingir o reflexo desejado. Em contraste, FRAP requer o laser a ser focada directamente sobre a amostra e posicionado com precisão espacial elevada para permitir que o branqueamento de estruturas definidas ou regiões. A configuração de Till fotônica que usamos em nossos experimentos fornece um controle muito rápido e intuitivo do diaparâmetros ESE. Dois galvanómetro controlados espelhos são usados para ajustar a posição FRAP em x, y ou para definir o ângulo de incidência na TIRF. Um espelho terceiro é usado para alternar entre os caminhos do feixe separados para TIRF e iluminação FRAP (o laser é ampliado pelas lentes adicionais no caminho TIRF). Todas as configurações são controladas pelo software LA (aquisição vivo) e calibrações pode ser rapidamente realizada para cada experiência para atingir as condições óptimas. Este software também permite a definição de posições lixívia na aquisição da imagem, que é essencial para experimentos FRAP em estruturas móveis.
Usando esse recurso podemos excluir treadmilling de filamentos MBL como fonte para a motilidade observada de Mbl contendo manchas (Fig. 3E). Esta observação motivou a busca de mecanismos alternativos de motilidade e, finalmente, resultou na nossa identificação de um tipo completamente inesperada de motilidade, onde os complexos proteicos intracelulares (incluindo MBL) são movidos através da activity de parede celular sintetizar enzimas que residem no exterior da célula 4. De um modo semelhante, fomos capazes de observar os rearranjos lentas de proteínas de levedura membrana plasmática, que distribuem em rede domínios semelhantes cobrindo toda a superfície da célula (Fig. 3F).
Estes exemplos ilustram como a dinâmica e padronização de proteínas corticais podem ser avaliados diretamente através da combinação de TIRF e técnicas de FRAP.
4. Os resultados representativos
Figura 1. Ajustando os parâmetros. A. Co sujo vs limpoverslip. Sinal de fundo resultante de pó sobre a lamela interferir com um potencial GFP / RFP sinal, lamela limpo tem menos de fundo. B. Custom-feitas controlador de aquecimento eléctrico mostrando a temperatura definido (a), temperatura à sonda (b) e amostra titular (c) . C. Pma1GFP proteína de levedura trabalhada com ângulos de incidência decrescente (de cima da esquerda para a direita em baixo). Imagens mostram uma perda súbita de sinal, com o ângulo crítico e diminuição progressiva da informação estrutural e relação sinal-ruído. D. campo desigual de vista. Uma suspensão densa de partículas fluorescentes é imaginado, mostrando que apenas uma parte do campo de visão é em foco. Barras de escala em A, B: 2 m, em C: 10 mM.
Figura 2. Imagens a cores de casal. A. sangrar através de Pil1RFP. Pil1RFP está animadocom 488 nm e um laser de 561 nm ea fluorescência é gravado com um filtro passa banda dupla. Sinal de Pil1RFP é fracamente visível no canal de GFP. Barra de escala 2 passos mM B. típicos para evitar sangramento através de imagens a cores de casal. Depois de imagem das células com diferentes conjuntos de filtros, eles são deconvolved e alinhados (usando esferas fluorescentes) antes de serem fundidos para análise.
Figura 3. Resultados representativos. A. Comparação de distribuição GFPMbl em B. subtilis utilizando TIRF microscopia de epifluorescência ou regular (EPI). Azul: limite da célula a partir da imagem de campo claro. Imagens representam projeções médias de uma série de tempo para indicar a área coberta por manchas MreB móveis monitorados com diferentes modos de imagem. B. Melhor resolução axial e contraste de imagem TIRFs tomadas do PbpHGFP transpeptidase em B. subtilis. setas indicam coloração septal que aparece como o anel em epifluorescência, como manchas na TIRF. Tempo de exposição:. 100 ms Comparação entre C. epifluorescência e iluminação TIRF do Bit61 componente TOR complexo em S cerevisiae.. Bit61 é muito fracamente expressa 9. Tempo de exposição: 250 ms D. Comparação de diferentes métodos de processamento de imagem.. Série mostrando a imagem TIRF-prima de Pma1GFP, subtracção de Gaussian ou Mediana imagens desfocadas, bem como de desconvolução usando o algoritmo de probabilidade máxima em Huygens. E. TIRF-FRAP de uma única mancha GFPMbl (acima asterisco) movendo-se através de um B. subtilis celulares. O quimógrafo do patch não-recuperando e do perfil de intensidade ao longo da quimógrafo (linha pontilhada) regra para fora treadmilling como fonte de movimento. F. TIRF-FRAP de uma célula de levedura que expressa Pma1GFP. Note-se a fechamento difusivo dolacuna no padrão de coloração cortical. Barras de escala: 2 uM. Tempo em segundos.
Filme 1. Filme mostrando B. células subtilis expressando uma proteína de fusão RFP sobre uma lamela sujo. Observe que o sinal de RFP é dificilmente distinguível do ruído de fundo. Tempo de ciclo de 100 ms. Clique aqui para ver filme .
Filme 2. Filme de Pma1GFP com diferentes ângulos de incidência. O ângulo é alterada a partir subcrítico ao ângulo crítico, até que o sinal é perdida. Note, em sinal de ângulo subcrítico interna é visível, provocando imagens com ruído até em um ângulo crítico apenas a proteína na PM é visível. Tempo de ciclo de 200 ms. Barra de escala: 2 micra. Clique aqui para ver filme .
Filme 3. Filme de levedura GFPRas2, mostrando alternação RAW e imagens deconvolved TIRF. GFPRas2 é uma proteína de rápida evolução (T1 / 2 de 2s dados não publicados), rápido tempo de aquisição são importantes para resolver o comportamento dinâmico. Tempo de ciclo de 150 ms. Barra de escala: 2 micra. Clique aqui para ver filme .
Movie 4. Filme duplo de cor de levedura e proteínas Fet3GFP Pma1RFP. Os 10 primeiros quadros representam imagens RAW e últimos quadros são deconvolved. Este filme mostra a importância de processamento de imagem para a análise de colocalização. As imagens borradas primas tornam-se afiada, fazendo uma análise possível. O tempo de ciclo 5 s. Barra de escala: 2 micra. Clique aqui para ver filme .
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Discussion
Microscopia TIRF é a técnica de escolha para as proteínas de imagem periféricos. A profundidade de penetração de baixo do campo evanescente minimiza de fora do foco de luz, o que leva a um sinal muito bom para relação de ruído e permite que a aquisição de dados com altas taxas de quadros de imagem, ou de proteínas muito fracamente expressas. A combinação de alto contraste e altas taxas de quadros faz TIRF microscopia uma ferramenta perfeita para imagens espaço-temporais dinâmica de proteínas corticalmente localizadas. Curiosamente a parede celular espessa circundante muitos microorganismos não prejudicar imagem de proteínas periféricas por TIRF. Na verdade, a geração real da evanescente muito provável ocorre na interface entre a parede celular e 5,10 membrana plasmática. Reflexão da luz que sai a célula pode mesmo conduzir a propagação da luz ao longo da parede da célula, o que pode explicar a grande área de superfície que pode ser trabalhada em células de levedura 8.
Para melhor qualidade de TIRF imidades é crucial ter um sistema de microscopia bem calibrado. O laser deve ser focado e alinhado antes de cada sessão de imagem. Lamelas devem ser limpos (Fig. 1A) e as células têm de ser adequadamente imobilizada. Para sangramento de cor duplas de imagem através de espectrais tem de ser tida em conta ou eliminada por meio de filtros filtros de conjuntos de faixa de emissão separada. Isto, obviamente, vêm com o preço de aquisição de vezes mais lento devido à mudança do filtro mecânico. Rodas de filtros rápidos ou fontes galvanômetro orientados iluminação pode contornar esse atraso, se necessário. Alternativamente, o fluoróforo crítica (SDP) pode ser utilizado na mais fraca proteína expressa em um par, minimizando o nível de interferência de sinal.
Apesar do alto contraste, as imagens tiradas com um microscópio TIRF conter o ruído significativo. Para remover este ruído e aumentar ainda mais imagens de contraste de imagem podem ser processados com várias etapas de filtragem. O método com os melhores resultados no nossoexperiência é deconvolução 2D. Isto requer a medição experimental do PSF para cada amostra e condição microscópio. No entanto, esta pode ser realizada facilmente e rapidamente, usando esferas fluorescentes misturados na amostra respectiva. Para experiências de duas cores estes grânulos podem adicionalmente ser usado para o alinhamento do canal.
Nós demonstramos as vantagens da utilização de microscopia TIRF para imagiologia de proteínas em microorganismos corticais. Combinação de TIRF e processamento de imagem permite a aquisição de imagens com altas taxas de quadros (<50 ms) e contraste e também permite a visualização de proteínas fracamente expressas como Bit61. Uma vantagem adicional de se realizar imagiologia TIRF em microorganismo é que a pressão de turgescência nestas células leva a membranas plasmáticas planas, e minimiza efeitos topológicos aos sinais TIRF.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Sociedade Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
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