Summary
우리는 신속하게 식별하고 마우스 배아 줄기 세포 유지 및 자기 갱신을 조절 유전자를 특성화하기 위해 형광 기자 분석을 설명합니다.
Abstract
Pluripotency과 자기 갱신은 배아 줄기 세포의 두 정의 특성 (ES 세포)입니다. 기본적인 분자 메커니즘을 이해하는 것은 크게 발달 생물학 연구, 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의료 (1,2 년 검토)의 ES 세포의 사용을 촉진합니다.
ES 세포 유지 및 자기 갱신의 소설 규제의 식별 및 특성을 신속하게하기 위해 우리는 양적 Oct4GiP 세포에게 3을 사용 마우스 ES 세포의 자기 갱신 상태를 측정하는 형광 리포터 기반의 분석을 개발했습니다. Oct4GiP 전지는 4,5 Oct4 유전자 프로 모터 영역의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현. Oct4는 차별 6,7 중에 ES 세포 자기 갱신이 필요합니다, 그리고 고도의 ES 세포에 표현되며, 빠르게 아래쪽 규제. 그 결과, 기자 세포에서 GFP 발현과 형광 성실하게 상호ES 세포 정체성 5 및 형광 - 활성 셀 정렬과 (FACS) 분석 밀접하게 단세포 레벨 3,8에서 세포의 자기 갱신 상태를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
RNAi와 결합, Oct4GiP 기자 분석은 신속 ES 세포 유지 및 자기 갱신 3,8의 규제를 파악하고 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 자기 갱신을 시금위한 다른 방법과 비교했을 때, 그것은 더 편리하고 민감한, 양적, 그리고 낮은 비용입니다. 이러한 높은 처리량 화면 또는 유전자 epistasis 분석과 같은 대규모 연구 또는 접시 384 - 잘 - 그것은 96에 실시 할 수 있습니다. 마지막으로, 다른 혈통 특정 기자의 ES 세포 라인을 사용하여, 우리가 여기서 설명하는 분석도 ES 세포 분화 동안 운명 사양을 공부하고 수정할 수 있습니다.
Protocol
1. Oct4GiP 마우스 ES 세포 유지 보수
Oct4GiP 전지는 친절 박사 오스틴 스미스에 의해 제공되었다. 그들은 Oct4-GFPiresPac transgene 4,5 들고 129/Ola 마우스에서 파생되었다. 그들은 ESGRO 전체 더하기 clonal 학년 중간 (Millipore), 또는 M15 매체의 젤라틴 코팅 조직 배양 플레이트에 유지됩니다 DMEM (Invitrogen)은 15% FBS, 1000 U / ML ESGRO (Millipore), 1X 비로 보충 필수 아미노산 (Invitrogen), 1X EmbryoMax Nucleasides (Millipore) 및 10 μm의 β-메르 캅 토 에탄올.
- 30 분간 실온에서 0.1 % 젤라틴 (시그마) (0.1 ML 젤라틴 용액 / cm 2)와 코트 판.
- 플레이트 Oct4GiP의 ~ 2시 젤라틴 코팅 접시에있는 세포 × 10 4 / cm 2.
- 0.05 %의 트립신과 함께 이틀 세포를 분할.
2. Oct4GiP 셀에서 siRNA의 Transfection
Oct4GiP 기자 분석은 대부분의 convenien입니다M15 매체 또는 접시 384도 (코닝 또는 BD) - tly 젤라틴 코팅 평평한 바닥에서 96 실시. 전체 절차는 그림 1에 설명되어있다.
- siRNA - 지질 단지 어셈블리 :
- 96 - 웰 플레이트에 transfection 들어, U-바닥에 siRNA - 지질 단지 96 - 웰 플레이트를 조립.
- 각 우물로, 10 μl OptiMEM (Invitrogen)와 0.3 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen)를 혼합하고 5 분 동안 상온에서 품어.
- 지질 OptiMEM 혼합물에 5 pmol siRNA를 추가하고 또 다른 15 분 동안 품어. siRNA : 6ul : 지질 비율이 100 pmol입니다.
- 멀티 채널 피펫으로 젤라틴 코팅 평면 바닥 판으로 U-맨 아래 판에서 OptiMEM의 siRNA-지질 단지를 전송합니다.
- 384 잘 접시에 transfection 들어, 0.1 μl Lipofectamine 2000 및 10 μl OptiMEM 2 pmol siRNA를 이용하여 siRNA - 지질 단지를 준비합니다.
참고 : 최종 siRNA 농도의transfections 50 nm의입니다. 3-4 생물 학적을 수행하면 각 siRNA의 transfection을 위해 복제합니다. 플랫 바닥 젤라틴 코팅 플레이트로 U-바닥 플레이트와 나누어지는의 siRNA-지질 단지의 마스터 섞어 설정합니다.
- Oct4GiP 전지 도금 및 transfection :
- 96 - 웰 플레이트에 transfection 내용 Oct4GiP 세포를 수집 및 9 X 10 4 셀 / ML에 신선한 M15 매체에서 그들을 resuspend.
- 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 세포 현탁액을 100 μl를 추가합니다.
- 3-5 번 아래로 pipeting 및하여 우물에 사전 aliquoted siRNA-lipids의 단지와 세포 현탁액을 섞는다. 다른 siRNA의 transfections 대한 정보를 변경합니다.
- 384 잘 번호판, resuspend의 Oct4GiP 세포의 Transfection을 위해 6 X 10 4 셀 / 각도에 대한 ML 및 나누어지는 30 μl 세포 현탁액.
참고 : 최적의 셀 도금 밀도는 일반적으로 3 × 10 5 세포 / ㎝ 2입니다하지만 m불안하다는 크게 세포 성장이나 생존에 영향을 siRNAs에 대한 최적화가 필요합니다. 낮은 도금 밀도는 transfection 동안 가난한 세포 생존으로 이어질 것입니다. 높은 도금 밀도가 높은 세포 합류 유도 차별화에 의한 높은 배경으로 이어질 것입니다. 만약 2-4 × 10 5 세포 / ㎝ 2 사이의 필요한 테스트 도금 밀도.
- 매체 변화 :
- 다중 채널 흡인기 (코닝) 또는 진공 지팡이 (VP-학술)을 사용하여 오래된 매체를 제거합니다. 접시의 바닥에 전지를 긁히지 않게 조심해라.
- 매일 멀티 채널 피펫을 사용하여 신선한 ES 세포 매체 (384 잘 접시 96 - 웰 플레이트에서 30 μl 100 μl)으로 세포를 먹이.
3. FACS 분석
- 세포 분열 :
- 나흘 transfection 후, 멀티 채널 흡인기 (코닝) 또는 진공 지팡이 (VP-학술)을 사용하여 매체를 제거합니다.
- 96 - 웰 플레이트 들어, 100μ으로 한 세포를 헹굼리터 PBS.
- 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 25 μl 0.25 %의 트립신을 추가합니다.
- 가끔 교반과 오분 동안 상온에서 부화하고, 시각 세포의 완전한 분리를 보장하기 위해 검사한다.
- 트립신을 inactivate 반복 pipetting하여 단일 세포 현탁액으로 세포를 떼어 놓다 10 % FBS와 PBS의 90 μl를 추가합니다.
- 384 잘 접시의 경우 10 % FBS와 30 μl PBS 갖춘 10 μl 트립신과 끄지으로 세포를 끊을.
- FACS 분석 :
- HTS 유닛 또는 기타 유사 시설의 FACS 분석기 (예 : Accuri 또는 Intellicyt 등)을 갖춘 BD LSRII FACS 분석기에서 GFP의 형광 분석.
- HTS의 높은 처리량 모드를 사용하여 세포 현탁액의 10 μl를 분석합니다. 1.0 X 10 4 세포로 카운트 임계값을 설정합니다.
- 앞으로 대 사이드 분산형 음모에 세포를 캡처하는 PMT 전압과 임계값을 조정합니다. forw에서 라이브 세포 인구를위한 게이트ARD 대 사이드 분산형 계획.
- GFP 채널에 대한 히스토그램 플롯을 만듭니다. 세포 ~ 10 %는 모방이나 제어 siRNA transfected 세포에 GFP-음수로 표시되도록 GFP 채널의 게이트를 설정합니다.
- % 차별화된 세포 세포 = %의 GFP-음성 : 각 치료에서 % GFP-음성 세포를 결정합니다. 2 꼬리 T-테스트를 사용하여 실험 및 제어 siRNA의 transfections 사이 % 차별화된 세포를 비교하고, P-값 <0.01로 긍정적인 안타를 득점.
4. 대표 결과
Oct4, Nanog, 그리고 Sox2는 ES 세포 자기 갱신 6,7,9-11의 유지에 중요한 역할을 세 유전자 있습니다. 그림 Oct4GiP 기자 분석이 쉽게 이러한 요인을 입을으로 인한 차별을 감지할 수있는이 공연 Oct4GiP ES 세포.
그림 2A는 ES로 유지하면 Oct4GiP의 ES 세포는 GFP-양수 보여줍니다 . 그림 2B 세포는 앞으로 대 측면 분산형 계획 및 제어 또는 Oct4-siRNAs로 transfected Oct4GiP 세포의 GFP 채널의 히스토그램을 보여줍니다. 죽은 세포와 파편 GFP-음성이며 배경을 증가하므로 그것은 앞으로 대 측면 분산형 플롯에서 라이브 세포에 대한 게이트가 필요합니다. 한편, 가능한 세포 대단히 짧은 시간을 제외하도록 차별을 이중어 항상 필요하지 않습니다. 제어 siRNA transfected 세포에서는 세포의 대부분은 GFP 양성해야합니다. 명백한 GFP - 부정적인 인구가 제어 siRNA transfected 우물에있는 경우, 시작 Oct4GiP 세포 또는 transfection 절차가 손상되었을 수 있으며 결과는 interpretable되지 않을 수 있습니다.
그림 2C는에서 % 차별화된 세포 (% 차별화된 세포 = % GFP-음성 세포)의 막대 그래프를 보여줍니다 제어, Oct4-, Nanog-, 그리고 Sox2-siRNA transfected 세포.
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1 그림. Oct4GiP 기자 분석의 개요.
그림 2. Oct4GiP 기자 분석은 Nanog, Oct4, Sox2 또는 입을 의한 ES 세포 분화를 검색할 수 있습니다. ) E14Tg2a (야생 형, 블랙 라인) 및 Oct4GiP (녹색 라인) 세포는 FACS로 분석되었다. GFP 채널의 히스토그램은 Oct4GiP 세포가 GFP 양성한지 확인하십시오. B) Oct4GiP 세포는 제어 또는 Oct4-siRNA와 96 - 웰 플레이트에 transfected와 FACS는 사일 transfection 후 분석했다 보여줍니다. 앞으로 transfected 세포의 GFP 채널의 측면 분산형 플롯과 histograms 수와 같습니다. C)가 Oct4GiP 전지로 transfected되었다 제어, Nanog -, Oct4-, 또는 Sox2-siRNA. % 차별화된 세포는 % 사일 transfection 후 세포가 GFP-음성으로 결정되었고, + / - 뜻으로 꾸몄다되었다 - 평균의 표준 오차 (N = 4).F = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg"대상 = "_blank"> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리가 위에서 설명 Oct4GiP 기자 분석은 정량적 자기 갱신 대 분화의 정도를 측정할 수 있습니다. 이러한 형태학 기반의 12 확산 / assays 생존 기반과 같은 다른 가능한 방법, 비교, 그것은 높은 감도 및 처리량뿐만 아니라 ES 세포 상태의 더 직접적인 측정을 제공합니다. 그것은 따라서 잘 대형 스크린 및 유전자 epistasis 분석에 적합합니다. 실제로, 우리는 다른 사람이 성공적으로 게놈 전체의 RNAi 화면 3,8에 대한 Oct4GiP 기자 분석을 사용 하였다. 모든 assays처럼, 그러나 그것은 또한 제한 사항이 있습니다. 그것은 직접 또는 간접적으로 Oct4 프로 모터의 활동을 조절하는 유전자를 공부하고 그것이 거짓으로 사후 transcriptionally GFP 발현, 안정성, 또는 기능에 영향을 미치는 유전자를 식별할 수 사용될 수 있습니다. 따라서 추가적인 assays 또는 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 염색법 13 (Millipore, SCR004)과 immunofluorescence 염색법이나 정량 RT와 같은 보조 스크린,pluripotency 마커-PCR은 3,8,12,14이 방법에서 얻은 결과를 확인하기 위해 필요합니다.
Oct4GiP 기자 분석은 효율적인 유전자 입을에 의존합니다. 효과적인 siRNAs하고 효율적인 siRNA를 transfections는 분석의 성공의 열쇠입니다. Google은 siRNA의 transfections 가진 기자 분석의 사용을 설명했지만, 분석도 침묵하거나 관심 overexpress 유전자로 DNA를 transfections으로 수행할 수 있습니다. DNA를 transfection 효율 siRNAs의 그것보다 일반적으로 낮은과 표현형의 강도를 줄일 수 있습니다.
무엇이 프로토콜에서 설명되었다 외에 Oct4GiP 기자 분석은 부정뿐만 아니라 자기 갱신을 조절 유전자를 식별 및 특성화를 위해 수정할 수 있습니다. 이 경우, 세포가 siRNAs로 transfected 수 있으며, 분화 조건에서 배양해. 자기 갱신의 부정적인 규제의 입을 것은 자기 갱신을 개선하고 D가 될 수 GFP 발현을 유지할 것이다마찬가지로 현재의 프로토콜에 설명된 FACS에 의해 etected.
Oct4GiP 기자 세포 외에 같은 Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089)와 Rex1-GFP 19 전지와 같은 ES 세포 특정 발기인를 사용하여 다른 기자 셀 라인도 생성되었습니다. 그들은 또한 동일한 전략을 사용하여 ES 세포 자기 갱신과 유지 보수를 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 이 ES 세포 마커 유전자 발기인의 활동과 특이성에 눈에 띄는 차이점이 있기 때문에 그러나 이러한 기자 셀 라인은 백그라운드 레벨 및 감도 면에서 다르게 행동하기 때문에 서로를 보완합니다. 마지막으로, 다른 혈통 특정 기자의 ES 세포 라인을 사용하여, 우리의 전략은 ES 세포의 운명 - 사양을 연구하고 포유류의 초기 개발을위한 체외 모델에서와 같은 ES 세포의 사용을 촉진하기 수정할 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 읽고 원고를 편집 브래드 Lackford 감사드립니다. 이 연구는 환경 건강 과학, 건강 교내 연구 프로그램 Z01ES102745 국립 연구소 (GH까지)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
