Summary
Um método de enumeração de células CD4, o α-teste, é descrito que utiliza saliva total para fornecer contagens de CD4 rápidos e precisos. As α-teste tostões custos e elimina a necessidade de formação técnica, reagentes caros, tais como anticorpos monoclonais, instrumentação, refrigeração, transporte de amostras, bem como coleta e manuseio de sangue.
Abstract
Há uma necessidade urgente de enumeração CD4 acessível para monitorar a doença HIV. Enumeração de CD4 está fora de alcance em regiões com recursos limitados, devido ao tempo e as restrições de temperatura, a sofisticação técnica e custo dos reagentes, em particular anticorpos monoclonais para medir o CD4 nas células sanguíneas, o único método atualmente aceitável. Uma estratégia comumente utilizada laboratório de economia de custos e economia de tempo é de calcular, em vez de valores de medidas determinadas no sangue. Por exemplo, os níveis de LDL são calculados usando os níveis medidos de colesterol total, HDL e triglicéridos 1. Assim, a identificação de células livres que se correlaciona directamente regulam o número de células T CD4 + poderiam fornecer um método preciso para calcular contagem de células CD4, devido à relevância fisiológica dos correlatos.
O número de células estaminais que entram no sangue e destinam-se a tornar-se circular células T CD4 + é determinado pelo quimiocina CXCL12 umnd seu receptor CXCR4 devido à sua influência sobre a locomoção 2. O processo de locomoção de células estaminais no sangue é adicionalmente regulada por superfície celular leucocitário humano elastase (HLE CS) e da HLE CS-reactivo activo α 1 inibidor de protease (α 1 PI, α 1 antitripsina, SERPINA1) 3. Em HIV-1 da doença, α 1 PI é inactivado devido a processos de doença 4. Nas categorias iniciais assintomáticos de HIV-1 da doença, activa α 1 PI foi encontrado para ser abaixo do normal em 100% de HIV-1 não tratados (doentes mediana = 12 uM, e para conseguir os níveis normais durante as categorias sintomáticos 4, 5. Este padrão tem sido atribuído à inactivação imunitário, não para a síntese insuficiente, a inactivação proteolítica, ou oxigenação. Observou-se que em HIV-1 indivíduos com> 220 CD4 células / uL, as contagens de CD4 foram correlacionados com os níveis séricos de activa α 1 PI (r 2 = 0,93, p < 0,0001, n = 26) e inativos α 1 PI (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 26) 5. A administração de α 1 PI ao HIV-1 indivíduos infectados e não infectados resultou em aumentos dramáticos na contagem de CD4, sugerindo α 1 PI participa na regulação do número de células T CD4 + no sangue 3.
Com a estimulação, a saliva contém todo exsudato seroso suficiente (plasma contendo material proteináceo que passa através das paredes dos vasos sanguíneos na saliva) para permitir a medição de ativos α 1 PI ea correlação dessa medida é prova de que é um método preciso para calcular os valores de CD4. Resumidamente, sialogogues tais como goma de mascar ou ácido cítrico estimular a exsudação de soro na saliva boca inteira. Depois de estimular a exsudação de soro, a actividade de soro α 1 PI na saliva é medido pela sua capacidade para inibir a actividade da elastase. Pâncreas suíno elastase (PPE)é uma fonte facilmente disponível barato de elastase. PPE liga-se a α 1 PI formação de um complexo um-para-um que impede PPE de clivar os seus substratos específicos, um dos quais é o péptido colorimétricas, succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). A incubação de saliva com uma concentração saturante de EPI durante 10 min à temperatura ambiente permite a ligação de PPE para todas activas α a 1 PI na saliva. A inibição resultante de EPI por activo α 1 PI pode ser medido através da adição do substrato PPE SA 3 NA. (Figura 1). Embora as contagens de CD4 são medidos em termos de volume de sangue (CD4 células / mL), a concentração de α PI 1 na saliva está relacionado com a concentração de soro na saliva, não a um volume de saliva desde que o volume pode variar consideravelmente durante o dia, por pessoa para pessoa 6. No entanto, virtualmente toda a proteína na saliva é devido ao teor de soro, eo teor de proteína de saliva é MEAmensuráveis 7. Assim, activa α 1 PI na saliva é calculada como uma razão para o conteúdo de proteína saliva e é denominado o α 1 Índice PI. Os resultados apresentados aqui demonstram que o Índice de α 1 PI fornece um método exacta e precisa fisiológica para calcular os valores de CD4.
Protocol
1. Prepare frescos Soluções de Trabalho
- TBS: 0,05 M de Tris pH tamponada, solução salina 7,8 (TBS). Preparar 60 ml de TBS / microplaca.
- PPE: elastase pancreática porcina, tipo 1 (PPE) é fornecida como uma suspensão. Agitar bem e diluir PPE em TBS a cerca de 0,01 U / ml. Preparar 6 ml de solução de trabalho / microplaca).
- SA 3 NA: succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). Preparar 0,1 M estoque SA 3 solução de NA em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e usar imediatamente ou armazenar a -20 ° C. Preparar solução de trabalho 6ml / microplaca, diluindo estoque SA 3 solução de NA 1/100 em TBS.
- Azul de Coomassie: Preparar uma solução-mãe de 10% de Coomassie Brilliant Blue R-250 (Azul de Coomassie) em TBS e usar imediatamente ou armazenar a -20 ° C. Preparar 6 ml de solução de trabalho por diluição de solução stock 1/1000 em TBS.
2. Prepare Saliva
3. Microplaca Set-up
- AMOSTRAS: Para cada poço de teste, é adicionado 20 uL de saliva para um volume final de 150 uL / poço. Misturar por pipetagem sem a introdução de bolhas.
- CONTROLE: O controle positivo contém PPE, mas não saliva. O controlo negativo contém saliva, mas não PPE.To o controlo positivo poço é adicionado 20 uL de TBS. Para o controlo negativo poço é adicionado 20 uL de saliva.
- INCUBAÇÃO PPE: Shake PPE solução funcionando bem. Adicionar 50 uL Solução de trabalho de PPE a cada poço excluindo os poços de controlo negativo. Para os poços de controlo negativo, adicionar 50 uL de TBS. Incubar 10 min a 23 ° C.
- Incubação do substrato: Adicionar 50 uL SA 3 solução de NA de trabalho para cada poço. Incubar 45 min a 23 ° C.
- Coomassie Blue:. Adicionar 50 mL solução Coomassie azul trabalho </ Li>
- Leitura: Ler a absorbância em leitor de microplacas, A 405 nm para detectar SA 3 NA clivagem que representa ativa α 1 PI e A 595 nm para detectar Coomassie Azul, que representa o conteúdo de proteína.
4. Calcule α 1 Índice PI
- NORMALIZE média, um 405 nm e um nm 595: Para cada triplicado, calcular a média. Subtrair a média Controle Negativo a partir da média da amostra. Para minimizar placa para a chapa de variação, normalizar as médias por divisão de cada média da amostra pela média Controlo positivo como se segue:
- CÁLCULO DO α 1 PI INEX: Divida o normalizado A 405 nm pelos normalizados A 595 nm:
5. Os resultados representativos
Para determinar se o α-teste pode ser adequado para utilização como um teste de rastreio ponto-de-cuidado para monitorar CD4 em endémicas, de recursos limitados regiões, saliva estimulada foi recolhido a partir de 20 fêmeas e 11 machos HIV-1 clínica sujeitos assistir para cuidados de rotina em Camarões. Consistente com observações preliminares durante o desenvolvimento da α-teste usando saliva coletada em Nova York, a α 1 Índice de PI na saliva coletadas em Camarões correlacionados com contagem de CD4 (r 2 = 0,91, p <0,0001. N = 31). A relação foi definida por uma curva sigmoidal 3-parâmetro que é consistente com uma relação dose-resposta (Figura 2A). A confiança de 95% e intervalos de predição são representadas com linhas azuis e vermelhas, respectivamente (Figura 2B).
Emum estudo anterior, verificamos que células T CD4 + apresentam ciclismo sinusoidal com periodicidade de 23 ± 3,5 dias em indivíduos HIV-1 e em indivíduos com a versão herdada de α 1 PI deficiência (PiZZ) 3. Aqui apresentado é um exemplo representativo de computer-generated análise da curva de seno de CD4 de bicicleta em um non-HIV-1 controle saudável exibindo 27 periodicidade dia (Figura 3A).
Gerado por computador análise da curva de seno de as células CD4 + alterações das células T em 6 indivíduos rendeu valores para pico-a-pico de amplitude e eixo de oscilação 3. Como seria de esperar, o eixo de oscilação foi correlacionada com a amplitude (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (Figura 3B). Em pacientes irão CD4 + T contagens de células, as alterações cíclicas na contagem de células CD4 T eram pequenos, e em pacientes com CD4 elevada contagem de células T, alterações cíclicas eram grandes.
Porque olinha de regressão representado na Figura 2 estima o eixo de oscilação eo eixo de oscilação é correlacionada com a amplitude, a amplitude pode ser calculado para a linha de regressão, assim, estimando como muito acima e abaixo das CD4 + de regressão da linha de células T que seria esperado a variar devido à ciclismo (Figura 3C). Sobrepondo a amplitude calculada na Figura 3C e do intervalo de confiança calculado na Figura 2B, verificou-se que a amplitude (linha verde) encontra-se dentro de 95% do intervalo de confiança (linha azul) (Figura 3D).
Figura 1. Resumo Procedimento: ácido cítrico Lugar na boca e coletar saliva. Adicionar saliva diluída a poços de uma microplaca em triplicado. Adicionar PPE a cada poço e incubar durante 15 min a 23 ° C. Adicionar o substrato PPE a cada poço e incubar durante 45 min a 23 ° C. Adicionar Azul de Coomassie e lida a 405 nm para detectar a actividade PPE e a 595 nm para a detecção da proteína.
Figura 2. Comparação da α-teste com o método padrão CD4 enumeração. A) O α-teste foi realizado por quantificação do α 1 Índice PI na saliva estimulada boca todo. Contagens de CD4 foram realizados por um laboratório independente médica por citometria de fluxo padrão. Sangue por citometria de fluxo e saliva foram coletadas na visita clínica mesmo. A relação entre o índice de α PI 1 e as contagens de CD4 foi definida por uma curva sigmoidal de 3 parâmetros (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) A confiança de 95% e intervalos de predição são descritos em azul e vermelho linhas, respectivamente.
Figura 3. Precisão de cálculo CD4 counts usando o Index.A α1PI) células T CD4 + exibiram ciclismo sinusoidal com 27 dias periodicidade de um controlo não-HIV-1 saudável. O eixo de oscilação é descrita (linha pontilhada vermelho). B) COMPUTADOR análise onda gerada seno de CD4 T ciclo celular foi usado para calcular a amplitude pico-a-pico eo eixo de oscilação em 4 de HIV-1, 1 sujeitos não-HIV -1 sujeito PiZZ, e do não-HIV-1 de controlo saudável representado na parte A. A relação entre T CD4 + amplitude da célula e do eixo de oscilação foi definida por 3-parâmetro curva sigmoidal (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6). C) A relação entre a amplitude sigmoidal e eixo de oscilação derivado, em parte B) foi utilizada para calcular a amplitude esperado (linhas verdes) de pontos ao longo da linha de regressão (linha preta) a partir da Figura 2. D) A amplitude esperada intervalo (linhas verdes) foi significativamente diferente do intervalo de confiança de 95% (linhas azuis) tal como determinado pelo Teste de Soma de Mann Whitney Rank (com base numa comparação da diferença média entre o intervalo de confiança de 95% e linha de regressão (63 células / ml) ea diferença entre a linha mediana de amplitude e da linha de regressão (37 células / uL), p = 0,001).
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Discussion
Soro não diluído contém 36 mM mediana α 1 PI e 3,6 mM α macroglobulina 2 (α 2 M) uma diferença de 10 vezes 8. Ambas as proteínas competir para a ligação a PPE. Estas duas características, concentração e PPE afinidade, têm sido exploradas para desenvolver um método que é capaz de medir especificamente α 1 PI no soro normal na presença de competir α 2 M 8. Este método pode detectar tão pouco como 50 nM μ 1 PI no soro de 0,3%. A uma diluição de soro de 2,5%, a ligação da α M de 2 a PPE torna-se indetectável, e esta diluição contém cerca de 900 nM α 1 PI e 90 nM α 2 M.
Em contraste com soro, que é composta de 10 vezes mais do que 1 PI α α 2 M, saliva boca inteira contém uma diferença de 20 vezes 9. Encontramos no presente estudo que não diluído, saliva estimuladacontém aproximadamente 30 vezes menos 1 PI α do soro ou aproximadamente 1200 nM α 1 PI e seria esperado que contêm aproximadamente 60 nM α 2 M. A diluição da saliva óptima para a α-teste foi encontrado para ser 13% saliva estimulada, e esta diluição seria de esperar que contêm aproximadamente 160 nM α 1 PI e 8 nM α 2 M, uma concentração de α M 2 que está abaixo do limiar de detecção no protocolo. Devido à baixa concentração de α 2 M, é possível determinar com precisão a actividade específica de α PI 1 na saliva sem preocupação com a competição de α 2 M. As medições de activa α 1 PI e teor de proteína na saliva, permitiu o cálculo do Índice de α PI 1 que foi encontrado para correlacionar com o método padrão para a medição CD4, citometria de fluxo. Importante, os resultados da análise de regressão (r Métodos de enumeração de CD4 não foram previamente tomadas em consideração a variação que é devido ao ciclismo. Em termos práticos, as contagens de CD4 pode variar por tanto como 200 células / ml entre o nadir e ápice com uma periodicidade de 23-27 dias, e isto é verdade independentemente do método para a medição células T CD4 + 3. Assim, o eixo da onda senoidal da oscilação fornece uma medida mais precisa de CD4 verdadeiros de um indivíduo + contagem de células T de medida de um único dia, porque o eixo de oscilação é constante hora a hora, semana a semana. Embora possa não ser possível medir directamente o eixo de oscilação para CD4 de um indivíduo + de células T, isto pode ser estimada usando uma média de CD4 + longitudinais contagens de células T como longos como a variação nas contagens de CD4 não exceda a amplitude esperada. Grande variaçãos na contagem de CD4 indicaria a influência de outras variáveis do que no ciclismo. A linha de regressão representado na Figura 2 é uma estimativa do eixo de oscilação. Cálculo da amplitude esperado acima e abaixo da linha de regressão revelou que a amplitude se encontra dentro do intervalo de confiança de 95%. A diferença média entre o intervalo de confiança de 95% e linha de regressão é de 63 CD4 células / ml, ea diferença média entre a amplitude e da linha de regressão é de 37 células CD4 / uL. Isto pode ser interpretado como significando que 95% dos níveis de CD4 calculada a partir das medições α-teste será dentro de aproximadamente 63 CD4 células / ml a partir das contagens de CD4 reais e que aproximadamente 58% desta diferença será devida à ciclagem de CD4. Assim, a precisão do α-teste é a distância entre o intervalo de confiança e amplitude que é de aproximadamente 26 células CD4 / uL, ea exactidão do α-teste é a correlação coefficient da linha de regressão que é 0,95 ou 95%. Existem várias limitações para o α-teste como aqui descrito, mas as soluções estão prontamente disponíveis. Por exemplo, embora o α-teste descrito utiliza um formato de microplacas, a capacidade de executar o teste α-utilizando uma diluição de saliva única permite que o teste α-para ser usado com a tecnologia de vareta, um instrumento livre de sistema, tecnologicamente simples. Aproximadamente 2% das amostras de saliva foram recolhidos em Camarões demasiado viscosa para manipular, e isso é consistente com a saliva recolhidas em New York City. A aplicação de ADNase a estas amostras pode ser usado para melhorar a viscosidade permitindo assim a medição 10. Uma solução adicional pode ser usar sialagogues farmacológicos que estimulam a secreção de saliva, especificamente através da via parassimpática contra simpática, assim, produzir saliva aquosa. Um tal sialagogue é pilocarpina 11. Finalmente, o α-teste não tem nenhumat ainda não foi validado, e isso é necessário para determinar se o desempenho é suficientemente discriminatória para os níveis críticos de CD4 12. Os níveis críticos de contagens de CD4 estão na região linear da curva de regressão sigmoidal que permitiu estes valores a ser calculado através de um algoritmo linear. Nesta população, a regressão linear para valores menores 860 CD4 células / uL (r 2 = 0,86, n = 30, p <2x10 -7) foi tão boa como a regressão sigmoidal (r 2 = 0,88, n = 30, p < 0,0001). A regressão linear para a1 PI Índices acima de 67, o que corresponde a cerca de 350 CD4 células / ml (r 2 = 0,88, n = 15, p = 0,002) foi tão boa como a regressão sigmoidal (r 2 = 0,89, n = 15, p <0,0001). No entanto, a correlação não foi estatisticamente significativa para a1 PI Índices abaixo 67 que correspondiam a <350 CD4 células / uL (r 2 = 0,17, p = 0,54, n = 15). Este é um valor crítico desde que WHO diretrizes recomendam uma contagem de CD4 <350 CD4 células / ml para se qualificar para o acesso à terapia anti-retroviral 13. Para melhor determinar o desempenho da α-teste e melhorar a sensibilidade em valores mais baixos, um adicional de 800 amostras de saliva estão sendo coletados nos Camarões a partir de 4 grupos: recém-nascidos, 2 anos, 3-5 yrs e 6-15 yrs e 16 anos e mais velhos. Em conclusão, a α-teste é fisiologicamente relevante para o número de células CD4 no sangue ainda pode ser realizada usando saliva proporcionando assim um não-invasiva, exactos e precisos método de ponto-de-cuidado para monitorizar CD4 nas regiões endémicas com nenhuma instrumentação a uma custo por teste, isto é menos do que um dólar.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
A pesquisa foi apoiada pela Harry Winston Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sialogogue, 0.05M citric acid | Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 | Sugar-Free Lemon dropS | |
| Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 | E1250 | |
| Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | S4760 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Tissue culture-treated, 96 well microplates | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 | 35-3072 | |
| Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm | MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 | Dynex P97277 |
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