Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

A Human egglederen Modell for etterforskning av Published: August 11, 2012 doi: 10.3791/4036
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,4
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

Summary

Vi beskriver en

Abstract

Genital skrift infeksjoner med Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) er den hyppigste seksuelt sykdom hos kvinner over hele verden. Ineffektiv clearance eller persistens av patogener kan føre til stigende infeksjoner i øvre kjønnsorganer og er ment å føre til kronisk inflammatorisk skade på infiserte vev 1,2. Som en konsekvens, kan alvorlig klinisk sekvele som bekkeninfeksjon (PID), tubal okklusjon og ufruktbarhet oppstår 3,4.

Det meste av forskningen med C. trachomatis har vært gjennomført i epiteliale cellelinjer (f.eks HEp-2 celler og Jakten-229) eller i mus. Men som med celle-kultur baserte modeller, har de verken gjenspeiler fysiologi av innfødte vev eller patofysiologien av C. trachomatis genital skrift infeksjoner i vivo 5. Ytterligere begrensninger gis av det faktum at sentrale signalveier kaskader (f.eks IFN-γ mediated JAK / STAT signalveien) som kontrollerer intracellulær Klamydia vekst fundamentalt forskjellig mellom mennesker og mus 6,7. Vi og andre derfor etablert en hel organ egglederen modell for å undersøke direkte interaksjoner mellom C. trachomatis og menneskelig egglederen celler ex vivo 8,9.

For dette formålet ble menneskelige eggledere fra kvinner som gjennomgår hysterektomi innsamlet og infisert med C. trachomatis serovar D. Innen 24 timer etter infeksjonen, prøven der analysert ved hjelp av scanning elektron mikroskopi (SEM) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) for å oppdage Chlamydia trachomatis mediert epitelial skader samt C. trachomatis inkludering formasjon i fallopian vev.

Protocol

1. Utarbeidelse av Chlamydia trachomatis serovar D Stock

  1. Infisere konfluent 175 cm 2 cellekultur kolbe inneholder Jakten-229 celler med 4 ml C. trachomatis D i SPG buffer.
  2. Inkuber en time ved 37 ° C under konstant risting.
  3. Tilsett 20 ml DMEM med 10% FCS og 240 mL cycloheximid.
  4. Inkuber i en fuktet inkubator for 48 timer ved 37 ° C og 5% CO 2.
  5. Tilsett 5 ml sterilt glassperler, sterk Rist for å løsne og ødelegge C. trachomatis harboring Jakten-229 celler.
  6. Samle supernatanten og legge en 5 ml sterile glassperler.
  7. Rock tre ganger for 1 min å ødelegge alle Jakten-229 celler og slipp C. trachomatis.
  8. Sentrifuger i 5 min ved 1000 RPMI og 4 ° C for å bli kvitt mobilnettet rusk.
  9. Samle supernatanten for smitte på 8 til 10 175 cm 2 cellekultur flasker konfluent grown med Jakten 229 celler.
  10. Inkuber hver kolbe med 4 ml SPG buffer og 4 ml supernatant fra tidligere infeksjon en time ved 37 ° C med konstant risting.
  11. Etter en time tilsettes 15 ml DMEM med 10% FCS og 230 mL cycloheximid etterfulgt av 48 timers inkubering ved 37 ° C og 5% CO 2.
  12. Tilsett 5 ml sterilt glassperler, riste å koble ut og ødelegge C. trachomatis harboring Jakten-229 celler.
  13. Samle supernatanten og legge en 5 ml sterile glassperler.
  14. Rock tre ganger for 1 min å ødelegge alle Jakten-229 celler og slipp C. trachomatis.
  15. Sentrifuger i 5 min ved 1000 RPMI ved 4 ° C for å bli kvitt mobilnettet rusk.
  16. Samle supernatanten.
  17. Fyll 40 ml av supernatanten i 50 ml Falcon rør, sentrifuger for 99 min med 11000 RPMI.
  18. Etter sentrifugering kast supernatanten og vask pellet med 1 ml SPG buffer.
  19. Homogeniserepellet i 1 ml SPG og delmengde 20 mL i en 1, 5 ml Eppendorf rør, lagring ved -70 ° C inntil bruk. Biologisk aktivitet av den tilberedte lager ble bekreftet i et etablert Jakten-229 celle infeksjon modell.

2. Utarbeidelse av Human egglederen

  1. Lagre menneskelige egglederne (HFT) fra kvinner som gjennomgår hysterektomi umiddelbart etter operasjonen i RPMI inneholder 5% FCS uten antibiotika i 4 ° C til forberedelse. Protokollen ble godkjent av etisk komité ved Universitetet i Lübeck (09-153). Kvinner inkludert i studien (alder 34 til 53) hadde ingen historie med tidligere C. trachomatis infeksjon. Vev av egglederne ble innhentet ved peripartum sterilisering på mors forespørsel under keisersnitt eller under hysterectomies grunn symptomatiske uterine muskelknuter i lutealfasen. All HFT ble testet negativt for C. trachomatis med PCR.
  2. Dissekere HFT i en petriskål inneholder RPMI med5% FCS uten antibiotika. Under hele behandlingen vevet skal dyppes i media for å hindre uttørking.
  3. Klipp av og kast bindevev og vev ødelagt under operasjonen.
  4. Etter disseksjon åpne HFT forsiktig med en liten skalpell.
  5. For ytterligere eksperimenter forberede stykker av vev i størrelsen 0,5 cm x 0,5 cm opp til 1 cm x 1 cm.
  6. For infeksjon butikken HFT eksemplar i 1 ml RPMI inneholder 5% FCS uten antibiotika. HFT prøvene ble smittet med 5.5x10 5 IFU (inkludering dannende enheter) av C. trachomatis.
  7. Inkuber HFT prøven i 37 ° C, 5% CO 2 og 21% O 2, samt i 37 ° C, 5% CO 2 og 2% 2 O i 24 timer.
  8. Etter inkubasjonstid samle prøven og oppbevar i Monti sin fiksativ i minst tre dager ved 4 ° C til SEM / TEM forberedelse.

3. Utarbeidelse av HFT Prøve for TEM

  1. ForTEM fjerne prøven fra Monti sin fiksativ og kuttet 2 x 2 mm til 4 x 5 mm biter. Den gjenværende vev kan brukes til SEM.
  2. Vask stykker med natrium cacodylate buffer, 7,35 pH i 1 time.
  3. Inkuber i 1% (w / v) osmium tetroxide i aqua dest. over natten.
  4. Fjern overflødig osmium tetroxide ved å vaske 6x5 min i natrium cacodylate buffer, 7,35 pH.
  5. Fjern vann ved å inkubere i økende konsentrasjoner av etanol i vann (v / v) (30% for 2 t, 40% for 2 t, 50% for 2 t, 60% for 2 t, 70% over natten, 80% for 2 h, 90% for 1 t, 95% for 1 t, 100% i 1 time.
  6. Vaske ut etanol for 2 x 15 min i propylen oksid og deretter overføre til en blanding av 50% (v / v) nylaget Araldite (inkludert alle komponenter) i propylen og inkuber natten.
  7. Overføring til nylaget Araldite (inkludert alle komponenter) i minst 1 time.
  8. Overføring til flate integreringsrettigheter former og fyll med Araldite.
  9. La Araldite herde forminst 48 timer ved 60 ° C
  10. Etter trimming av embedded prøve kutte semi tynne snitt (700 nm) på en ultramicrotome bruke glass kniver eller en HISTO diamant kniv og beis med Richardson er beis.
  11. Skjær ultra-tynne snitt (ca. 70 nm) med en diamant kniv og overføring til kobber nett (f.eks 150 kvadrat mesh).
  12. Flekk ultra-tynne snitt med 0,5% (w / v) uranyl acetat i aqua dest. etterfulgt av 3% (w / v) bly citrate i aqua dest. i en automatisk del Stainer. Alternativt kan seksjonene være farget manuelt ved å forlate tavler 15 min på et mettet sentrifugert løsning av uranyl acetat i aqua dest. etterfulgt av 0,3% bly citrate (w / v) i aqua dest.

4. Utarbeidelse av HFT prøven for SEM

  1. For SEM fjerne prøven fra Monti sin fiksativ, orientere med epitel vendt oppover på en 1,5 x 1 cm kork ark og fikse plass med insekt nåler.
  2. Overfør prøven på kork til egnede metall kurver ogVask i 30 min i natrium cacodylate buffer, 7,35 pH.
  3. Fjern vann ved å inkubere prøven i økende konsentrasjon av aceton / vann blandinger (v / v) 30% i 6 timer, 40% i 6 timer, 60% for 8 timer, 70% over natten, 80% for 2 t, 90% for 2 t og 100% over natten (være ekstremt forsiktige for å holde prøven kontinuerlig neddykket).
  4. Overføring til frisk 100% aceton og tørr prøven ved kritiske punkt tørking (temperatur 40 ° C, trykk 80 bar).
  5. Fjern nåler, kork og lim prøven med epitelet vendt oppover på SEM prøven mount utstyrt med en ledende karbon kategorien hjelp ledende karbon sement. Bruk flytende ledende sølv for å forbedre ledningsevne mellom fjellet og den ledende karbon kategorien.
  6. Forbered en ledende platina, gull eller palladium belegg av prøven ved hjelp av en frese coater.

5. Farging av Semi tynne snitt med Richardson er Stain

  1. La semi tynne snitt tørr på lysbildet.
  2. Flekk seksjoner med farging løsning ved 60 ° C i 1-2 min.
  3. Vask i aqua dest.
  4. Tørre seksjoner og dekkglass.

6. Representative Resultater

Innenfor den menneskelige egglederen infeksjon modellen var vi stand til å visualisere forskjeller i epiteliale morfologi mellom de ikke-infiserte kontroller (Figur 1) og C. trachomatis - infiserte rør (figur 2) under normoksisk tilstand. Karakteristiske morfologiske forskjellene antydet patogen-indusert hevelse og lysis av egglederen epitelceller som ikke kunne oppdages i ikke-infiserte kontroller. Bruke semi tynne snitt og transmisjonselektronmikroskopi vi var i stand til å bevise intracellulære C. trachomatis inkludering formasjonen i ex vivo infisert menneskelig egglederen vev (figur 3, 5) men ikke i ikke-infiserte kontroller (figur 4). Som oksygen konsentrasjonsjoner i det kvinnelige kjønnsorgan er allerede lavt under fysiologiske forhold 11, og ytterligere redusert i løpet av en inflammatorisk prosess vi også undersøkt vår modell under hypoksisk forhold. Foreløpige resultater indikerer modellen er nyttig å analysere Klamydia vekst og avkom under varierende oksygenkonsentrasjoner. Klamydia-indusert epitelial celle skade må skilles fra gjenstandene som er formidlet gjennom uforsiktig forberedelse og håndtering av egglederne før infeksjon (figur 6).

Figur 1
Figur 1. Scanning elektron mikroskopi (SEM) av en ikke-infisert menneske fallopian etter en dag inkubasjon i kontroll medium (grønn pil viser viser ciliated celle, blå pil non-ciliated celle).

Figur 2
Figur 2. Scanning elektron MICROS kopi (SEM) av en ex vivo C. trachomatis infisert menneskelig egglederen en dag etter infeksjon (hvit pil merket sprukket inkludering).

Figur 3
Figur 3. Semi tynne snitt viser typiske intracellulære inneslutninger (hvite piler) 1d etter smitte av den menneskelige egglederen med C. trachomatis ex vivo.

Figur 4
Figur 4. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) av en ikke-infisert menneske egglederen etter en dag inkubasjon i kontroll medium.

Figur 5
Figur 5. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) av en ex vivo C. trachomatis infisert menneskelig egglederen en dag etter infeksjon (hvite piler markerer Klamydia inneslutninger).

ve_content "> Figur 6
Figur 6. Scanning elektron mikroskopi (SEM) av egglederen epitel skadet ved uforsiktig forberedelse og håndtering av prøven (hvit pil mark destructed epitelvev).

Discussion

Visualisering av patogen-indusert skade på infisert vev er krevende og ofte begrenset til eksperimentelle prosedyrer i mus. Vi etablerte en ex vivo infeksjon modell i menneskelige egglederne å analysere C. trachomatis infeksjoner i øvre kvinnelige kjønnsorgan. Ved bruk av denne metoden, kunne vi visualisere C. trachomatis - indusert skade på menneske egglederen epitel innen én dag etter infeksjon. Cellular hevelse og lysis var typiske morfologiske endringer som ble observert i C. trachomatis - infiserte egglederne, men ikke i ikke-infiserte kontroller. TEM analyser viste at chlamydiae gjennomføre en typisk intracellulær utviklingsmessig syklus innenfor infiserte vev, som viser store inneslutninger med re-differensierte elementære organer, men også mindre inneslutninger med forstørrede reticulate organer som kan tyde på utholdenhet. Imidlertid ikke morfologiske bildet alene ikke nok til å diskriminere mellom replicating og vedvarende infeksjoner, som kjennetegnes av redusert metabolisme og økt motstand mot antimikrobielle stoffer 10.

Ødeleggelse av epitelet i infiserte egglederne er enten skyldes forstyrrelser av C. trachomatis - infiserte epitelceller etter ferdigstillelse av den intracellulære utviklingsmessige syklus og frisetting av smittsomme elementære organer eller utgivelsen av proinflammatoriske cytokiner 8. Patogen-indusert vevsskade og host-indusert immunreaksjoner mot C. trachomatis er ment å være de viktigste faktorene som fører til tap av epiteliale celle funksjon, fibroblast ombygging og endelig tubal infertilitet in vivo 8,11.

En av de store begrensningene i denne modellen er fraværet av betennelsesceller som vanskeliggjør analysen av sekundære effekter til den opprinnelige C. trachomatis infeksjon i egglederen epitel. Imidlertid er modellen aphensiktsmessig å undersøke ulike miljøforhold (f.eks oksygen innhold) og den første host-immunrespons i akutt C. trachomatis infeksjoner 8,9. Videre planer er å etablere en modell for testing av antimikrobielle midler mot C. trachomatis i hele den menneskelige egglederne og å karakterisere de metabolske tilstander av de ulike utviklingsstadier observert i tubal epitelet ved to-foton laser scanning mikroskopi.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av DFG-Cluster of Excellence "Betennelse grenseflater" (RA-Dersom RA-D). Vi er takknemlige for den gode teknisk assistanse av Kristin Wischnat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
Cycloheximide Sigma - Aldrich
SPG Buffer various see recipe below
Monti's fixative various see recipe below
sodium cacodylate buffer various see recipe below
Richardson's stain various see recipe below

Recipes:

1. SPG Buffer
  1. Add 75 g sucrose.
  2. Add 2.47 g disodium phosphate.
  3. Add 0.36 g monosodium phosphate.
  4. Add 0.72 g glutamic acid.
  5. Fill to 1 l with aqua dest.
  6. Adjust pH to 7.3.

2. 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.35.
  1. Add 42.80 g dimethylarsenic acid sodium salt.
  2. Add 68.46 g sucrose.
  3. Fill to 1 l with aqua dest. to get 0.2 M sodium cacodylate buffer.
  4. Before use dilute solution with aqua dest. to desired concentration and adjust pH to 7.35 if necessary.

3. Monti's fixative
  1. Add 156 ml 0.12 M sodium cacodylate buffer. 3.2 Add 25 ml 25% glutardialdehyde in aqua dest.
  2. Add 19 ml 10% paraformaldehyde in aqua dest.
  3. Add 3 ml 3% CaCl2 in aqua dest.
  4. Adjust pH to 7.35 and fill with aqua dest. to 312 ml final solution.

4. Richardson's stain
  1. Mix equal parts of 1% methylene blue in 1% aqueous borax solution and 1% Azur II in aqua dest.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping. J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).
  2. Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility. Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).
  3. Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).
  4. Mardh, P. A. Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).
  5. Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells. Mol. Cancer. 5, 55 (2006).
  6. Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells. Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).
  7. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
  8. Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection. Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).
  9. Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).
  10. Wyrick, P. B., Knight, S. T. Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin. J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).
  11. Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring. Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).

Tags

Medisin Infeksjon mikrobiologi fysiologi, Menneskelig egglederen vev modell scanning elektronmikroskopi transmisjonselektronmikroskopi
A Human egglederen Modell for etterforskning av<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Infeksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jerchel, S., Knebel, G., König, … More

Jerchel, S., Knebel, G., König, P., Bohlmann, M. K., Rupp, J. A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections. J. Vis. Exp. (66), e4036, doi:10.3791/4036 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter