Eiwit misfolding Cyclische Versterking van prionen

Samuel E. Saunders; Jason C. Bartz; Ronald A. Shikiya

doi:10.3791/4075

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Eiwit misfolding Cyclische Versterking van prionen

19.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4075

⸱

7 november 2012

Samuel E. Saunders¹ , Jason C. Bartz² , Ronald A. Shikiya²

¹Department of Civil Engineering, University of Nebraska at Lincoln, ²Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University

In dit artikel

Samenvatting

Protein misfolding cyclische amplificatie (PMCA) is een in vitro assay voor de studie van prion conversie en spanning en species barrières. Het kan ook worden gebruikt als een prion detectie assay.

Samenvatting

Prionen zijn infectieuze agentia die de onvermijdelijk fatale overdraagbare spongiforme encefalopathie (TSE) veroorzaken bij dieren en mensen ^9,18. De prion eiwit heeft twee verschillende isovormen, niet-infectieuze gastheer gecodeerd eiwit (PrP ^C) en infectieus eiwit (PrP ^Sc), een abnormaal gevouwen isovorm van PrP ^{C 8.}

Een van de uitdagingen van het werken met prion middelen is de lange incubatietijd voorafgaand aan de ontwikkeling van klinische tekenen die volgden gastheer inoculatie ^13. Dit traditioneel opdracht lange en dure dieren bioassay studies. Verder zijn de biochemische en biofysische eigenschappen van PrP ^Sc slecht vanwege hun bijzondere conformatie en aggregatietoestanden gekarakteriseerd.

PrP ^Sc kan zaad de omzetting van PrP ^C PrP ^Sc in vitro ^14. PMCA een in vitro techniek die wordt Advantage van dit vermogen gebruik sonificatie en incubatie cycli om grote hoeveelheden PrP ^Sc produceren hogere snelheid, een systeem met overmaat PrP ^C en kleine hoeveelheden van het PrP ^Sc seed ^19. Deze techniek heeft bewezen effectief te recapituleren de soort en stam specificiteit van PrP ^Sc omzetting van PrP ^C tot prionstam interferentie emuleren, en zeer lage niveaus van PrP ^Sc amplificeren van geïnfecteerde weefsels, vloeistoffen en milieumonsters ^{6,7,16, 23.}

Dit document beschrijft de PMCA protocol, met inbegrip van aanbevelingen voor het minimaliseren van verontreiniging, het genereren van consistente resultaten, en kwantificeren van die resultaten. We bespreken ook verschillende PMCA toepassingen, inclusief productie en karakterisering van besmettelijke prion stammen prionstam interferentie en de detectie van prionen in het milieu.

Protocol

1. Voorbereiden van de Apparatuur

Gebruik Misonix 3000 of 4000 Misonix sonicator (Farmingdale, NY) verbonden met een Thermo Electron Neslab EX-7 waterbad (Newington, NH) om een constante temperatuur te houden van 37 ° C. Sonificeer de monsters in 200 ul dunwandige buis PCR strips met gewelfd deksel verkregen Thermo Scientific (Waltham, MA).
Een gloednieuwe sonicator vereist een "break-in"-periode van continue werking ^9. Een twee maanden break-in periode bestaat uit een 40-sec sonificatie burst en 10 minuten incubatie cycli met de amplitude ingesteld op 10. Men moet opmerken erosie gehele oppervlak van de microplaat titanium hoorn (Figuur 1, panel B). Het circulerende water ziet er wit troebel als gevolg van erosie van de titanium microplaat hoorn. Dagelijks te vervangen dit water.
De amplificatie van PrP ^Sc varieert gedurende de microplaat hoorn. De beste PrP ^Sc amplificatie-efficiëntie kan bekomen wordeneen straal van 5 cm van het midden van de microplaat hoorn (zie figuur 1, paneel C).
Een ronde van PMCA bestaat 144 cycli. Elke cyclus bestaat uit 5 sec sonicatie en 10 min incubatie. Dit zal ongeveer inhouden tot 24 uur per ronde van PMCA.
Het vermogen van sonicatie op het bedieningspaneel van de sonicator paneel, varieert met het aantal PCR-buizen in de sonificator rek en de temperatuur van het circulerende water uit het waterbad. Garanderen dat het water in evenwicht is bij 37 ° C en niet invullen meer dan 30% van de tube sonicator rack (Figuur 1, panel C). Spreid de PCR-buizen door de microplaat hoorn. Hebben ten minste een rij van lege ruimte tussen PCR-tube-strips en laat niet meer dan vier buizen aan elkaar per strip verbonden (figuur 1, paneel C).
De kracht van sonificatie is cruciaal voor een succesvolle amplificatie prionstam. Terwijl sonicatie, stel de amplitude om een vermogen hebbenvariërend tussen 155 ~ 170 watt. In ons laboratorium het vermogen is ingesteld op zes en zeven voor de Misonix 3000 en Misonix 4000, respectievelijk.
Gebruik gedestilleerd water in het waterbad om te voorkomen dat accumulatie van hard water vlekken. Vervang dit water per week. Tijdens de incubatie en sonicatie cycli, zal het water condenseren op de microplaat hoorn deksel. Om condensatie te voorkomen, voeg een klein aquarium warmte-pad naar de top van de behuizing van het sonificator doos zoals weergegeven in figuur 1, paneel A.

2. Voorbereiding van de monsters

Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de Creighton University Institutional Animal Care en gebruik Comite en voldoen aan de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Voordat een weefselverzameltoestel, moet het dier verdoofd en transcardiaal geperfuseerd met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing met 5 mM EDTA bij pH 7,4 om bloed uit de hersenen en de remming van voorkomenPMCA reactie van het bloed ^7. Snel verzamelen dierlijke weefsels met behulp van aseptische techniek en hebben speciale dissectie-instrumenten voor elke prionstam. Na dissectie het weefsel plaatsen in een 1,5 ml microcentrifugebuisje, flash bevriezen op droogijs en bewaard bij -80 ° C tot homogenisatie.
De PMCA substraat (PrP ^C) oplossing te bereiden homogeniseer een geïnfecteerde hamster hersenen (UN BH) een 10% gewicht / volume (w / v) oplossing met ijskoude buffer conversie (zie deel 3) met een tissue Tenbroeck molen. Onder homogeniseren, wees voorzichtig dat u de lucht binnen in de molen om te voorkomen dat overmatige schuimvorming van de oplossing. Verduidelijken de oplossing door centrifugeren bij 500 xg gedurende 30 sec en de supernatant aliquot in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Bij -80 ° C tot verder gebruik.
De PMCA zaad (PrP ^Sc) te bereiden, homogeniseer een infectueus materiaal (hersenen, milt, lymfeknopen, andere weefsels of vervuilde grond) om een 10% w / v oplossing met ijskoude water en aliquot de oplossing in 0,6 ml microcentrifugebuizen. Bij -80 ° C tot verder gebruik.

3. Voorbereiden Conversie Buffer

Weeg 0,5093 g Triton X-100 in een 50 ml maatkolf (resultaat is een 1% eindconcentratie van Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland).
Voeg een complete proteaseremmer Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Duitsland).
Voeg 0,0931 g EDTA (dit zal resulteren in een 5 mM eindconcentratie van EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc Phillipsburg, NJ).
Stel de pH op 7,4 met 1 N NaOH.
Stel het volume op 50 ml met fosfaat gebufferde Dulbecco's fysiologische zoutoplossing (DPBS) (Mediatech Inc Manassas, VA).
Filtreer de oplossing door een 0,45 um nitrocellulose membraan met een vacuümfiltratie inrichting. De omzetting buffer kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende niet langer dan een maand.

4. Amplificatie van Prion stammen gebruik PMCA

Verdun de PMCA zaad in de PMCA substraat in een verhouding van 1:20 (ie mix 5 ul van de PMCA zaad en 95 ul van de PMCA substraat) in een PCR buis. Verwijder en bewaar een 15 pi aliquot bij -80 ° C gedurende unsonicated controle; dit unsonicated controle wordt gebruikt om de PrP ^Sc amplificatie via proteinase K (PK) digestie gevolgd door Western blot (WB) analyse kwantificeren. Een extra unsonicated controle kan gegenereerd worden door een tweede 15 pi aliquot bij 37 ° C voor de duur van de PMCA reactie. Een minimum van drie herhalingen nodig is voor statistische doeleinden.
Betreft de rest van het monster (70 ul) een ronde PMCA zoals afgebeeld op Figuur 1, Paneel A. Shake ze om 5 h water condensatie te vermijden op de gewelfde kap van de PCR buis.
Het monster buizen moeten worden gecentrifugeerd en voorzichtig gevortext (let erop dat de oplossing niet ingaan op de koepelvormige kap) voor het openen na een procedure te waarborgen homogeniseringeneity en vermijd mogelijke besmetting.
Voor seriële PMCA (sPMCA) korte incubatieperiode stammen (bijvoorbeeld HY TME, HaCWD of 263K), vul de gesonificeerde materiaal in een verhouding van 1:20 door overdracht 5 pl van het monster van gesonificeerde ronde in 95 pl vers geïnfecteerde hersenhomogenaat (Figuur 2, Paneel B).
Voor sPMCA lange incubatietijd stammen (bijvoorbeeld DY TME, 139H, 22CH, 22AH of ME7H), vul de gesonificeerde materiaal in een verhouding van 1:1 door de overdracht 50 ul van het monster van gesonificeerde ronde in 50 pl vers geïnfecteerde hersenhomogenaat (Figuur 2, Paneel B).
Verwijder twee 15 ul aliquots van de eerder verdunde sonicated mengsel (van stap 4.4 of 4.5) en een van hen opgeslagen bij -80 ° C en de andere bij 37 ° C (unsonicated besturingssystemen voor PMCA ronde). Onderwerpen de overblijfselen van een PMCA de tweede ronde.
Deze procedure kan onbeperkt worden herhaald. In ons laboratorium hebben wehebben uitgevoerd tot vijftien PMCA rondes, met de stam eigenschappen ongewijzigd blijven.
PK verteren de monsters. Voor een typische WB, mix 5 pi PK 80 ug / ml tot 5 pl monster (deze oplossing een uiteindelijke PK concentratie van 40 ug / ml zijn) en incubeer bij 37 ° C gedurende een uur. Voeg 10 ul van gel loading buffer. Kook deze oplossing gedurende 10 minuten. Laat de oplossing afkoelen en plaats 10 ul in de gel.
Om het succes van amplificatie berekenen WB voeren van de PK-gedigereerd samples om de hoeveelheid geamplificeerd PrP ^Sc schatten door ze te vergelijken met hetzij de unsonicated controles ^20,21 Figuur 2, Paneel C of in vaststaande PK-onverteerd recombinant PrP.

5. Het vermijden van Kruisbesmetting

Kritische stappen worden genomen om kruisbesmetting en het ontstaan van valse positieven door de novo vorming van protease resistente producten te minimaliseren.

Gebruik een speciale set van dissectie-instrumenten (dwz tang, pincet, schaar) voor monstername voor elke prionstam.
Voor homogeniseren geïnfecteerde hersenen worden gebruikt als substraat PMCA Veeg de pipetten met 1% bleekmiddel. Week de sonificator de PCR-buis rek, weefsel homogenisatoren, en PCR-buis deurvakken met 1% bleekwater gedurende 10 minuten en spoel grondig met gedestilleerd water.
Bedek het werkgebied met een frisse Versi-Dry Lab Soaker elke keer een nieuw monster worden gehomogeniseerd, een nieuwe PMCA experiment is om voorbereid te zijn, of wanneer aliquoteren tussen sPMCA rondes.
Gebruik nieuwe handschoenen elke keer nieuwe monsters worden behandeld (vooral bij het overbrengen van monsters tussen sPMCA rondes).
Gebruik korte sonicatie uitbarstingen voor elke PMCA cyclus. Cycli van 5 sec sonicatie gecombineerd met 10 min incubatie is voldoende om prionen te versterken zonder de novo genereren PrP ^{Sc 1,20,21,23,24.} Zoals andere laboratoria hebben aangetoond, waardoor desonicatie tijd, waardoor de amplitude sonificatie en uitbreiding van het aantal cycli PMCA verhoogt de kans op de novo PrP ^Sc vorming ^2.