Summary
Repliement des protéines amplification cyclique (PMCA) est un test in vitro pour l'étude de la conversion du prion et les obstacles souche et l'espèce. Il peut également être utilisé comme un test de détection de prion.
Abstract
Les prions sont des agents infectieux qui causent l'encéphalopathie spongiforme inévitablement fatale transmissible (EST) chez les animaux et les humains 9,18. La protéine prion présente deux isoformes distincts, le non-infectieuse codée par l'hôte de protéine (PrP C) et la protéine infectieuse (PrP Sc), une isoforme anormale pliée de PrP C 8.
L'un des défis de travailler avec les prions est la longue période d'incubation avant l'apparition des signes cliniques qui suivent le 13 inoculation d'accueil. Cette traditionnellement chargé longs et coûteux essais biologiques d'origine animale. En outre, les propriétés biochimiques et biophysiques de la PrP Sc sont mal caractérisées en raison de leur conformation inhabituelle et états d'agrégation.
PrP Sc peut engendrer la conversion de PrP C en PrP Sc in vitro 14. PMCA est une technique in vitro qui prend avantage de cette capacité en utilisant les cycles de sonication et d'incubation pour produire de grandes quantités de PrP Sc, à une vitesse accélérée, à partir d'un système contenant des quantités excessives de PrP C et des quantités infimes de la graine PrP Sc 19. Cette technique s'est avérée efficace pour résumer la spécificité d'espèce et la souche de PrP Sc conversion de PrP C, à imiter les interférences souche de prion, et d'amplifier de très faibles niveaux de PrP Sc dans les tissus infectés, fluides, et les échantillons environnementaux 6,7,16, 23.
Cet article détaille le protocole de PMCA, y compris des recommandations pour minimiser la contamination, des résultats constants, et de quantifier ces résultats. Nous discutons également plusieurs applications PMCA, notamment la production et la caractérisation des souches de prions infectieux, les interférences souche de prion, et la détection des prions dans l'environnement.
Protocol
1. Préparation de l'équipement
- Utilisez un 3000 Misonix ou Misonix 4000 sonicateur (Farmingdale, NY) relié à un bain Thermo Electron Neslab EX-7 de l'eau (Newington, NH) pour maintenir une température constante de 37 ° C. Soniquer les échantillons dans 200 pi à parois minces barrettes de tubes PCR avec bouchons bombés obtenus à partir de Thermo Scientific (Waltham, MA).
- Un appareil à ultrasons nouvelle marque nécessite un "break-in" période de fonctionnement continu 9. Une rupture dans le délai de deux mois se compose d'une salve sonication de 40 sec et cycles d'incubation de 10 minutes avec le niveau d'amplitude fixé à 10. On devrait observer l'érosion sur toute la surface de la corne de titane microplaque (figure 1, partie B). La circulation d'eau se penchera trouble blanche due à l'érosion de la corne de titane microplaque. Remplacer cette eau tous les jours.
- L'amplification de la PrP Sc varie tout au long de la corne de microplaques. La meilleure efficacité PrP Sc d'amplification peut être obtenu dansun rayon de 5 cm du centre de la corne de microplaques (voir la figure 1, partie C).
- Un tour de PMCA se compose 144 cycles. Chaque cycle se compose de 5 sonication sec et 10 min d'incubation. Ce sera à peu près entraînent à 24 h par tour de PMCA.
- La puissance du moteur de sonication, affiché sur le panneau de commande de l'appareil à ultrasons, varie avec le nombre de tubes PCR présentes dans la grille de sonication et la température de l'eau circulant dans le bain d'eau. Assurez-vous que l'eau est équilibrée à 37 ° C, et ne remplissent pas plus de 30% du portoir du sonicateur (figure 1, partie C). Répartir les tubes PCR à travers la corne de microplaques. Avoir au moins une rangée d'espace vide entre les barrettes de tubes PCR et de permettre au plus quatre tubes reliés entre eux par bande (figure 1, partie C).
- La force de sonication est essentiel pour une amplification souche de prion succès. Bien sonication, régler l'amplitude d'avoir une puissance de sortiecomprise entre 155 ~ 170 watts. Dans notre laboratoire, le niveau de puissance est réglé sur six et sept pour 3000 et Misonix Misonix 4000, respectivement.
- Utilisez de l'eau distillée dans le bain d'eau pour éviter l'accumulation des taches d'eau dure. Remplacer cette semaine de l'eau. Au cours des cycles d'incubation et sonication, l'eau de condensation se produit à l'intérieur du couvercle corne de microplaques. Pour éviter la condensation, fixez les tampons petit aquarium de la chaleur vers le haut de la boîte de l'enceinte de l'appareil à ultrasons comme le montre la figure 1, le panneau A.
2. Préparation des échantillons
- Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvés par les soins de l'Université Creighton animaux institutionnel et l'utilisation comité et se conformer aux Lignes pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Avant tout prélèvement de tissus, l'animal doit être anesthésié et transcardiaque perfusé à l'aide glacée phosphate de solution saline tamponnée avec EDTA 5 mM à pH 7,4 pour enlever le sang du cerveau et d'éviter l'inhibition de laRéaction PMCA par le sang 7. Recueillir les tissus animaux rapidement en utilisant une technique aseptique et des outils de dissection dédiées pour chaque souche de prion. Après dissection, placer le tissu dans un tube de 1,5 ml, flash à geler sur de la glace sèche, et de le stocker à -80 ° C jusqu'à homogénéisation.
- Pour préparer le substrat PMCA (PrP C) solution, homogénéiser un cerveau de hamster infecté (ONU BH) à un 10% en poids / volume (p / v) avec un tampon de conversion glacée (voir partie 3) en utilisant un broyeur de tissu Tenbroeck. Bien homogénéiser, veillez à ne pas prendre l'air à l'intérieur du broyeur pour éviter un moussage excessif de la solution. Clarifier la solution par centrifugation à 500 xg pendant 30 sec et aliquote du surnageant dans des tubes de 1,5 ml microtubes. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- Pour préparer la graine PMCA (PrP Sc) solution, homogénéiser une matière infectieuse (ganglions lymphatiques du cerveau, de la rate, d'autres tissus, ou des sols contaminés) à un 10% p / v de solution avec de la glace froide water et aliquote de la solution dans 0,6 ml microtubes. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
3. Préparation du tampon de conversion
- Peser 0,5093 g de Triton X-100 dans une fiole jaugée de 50 ml (résultat est une concentration finale de 1% de Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne).
- Ajoutez un inhibiteur de la protéase complète Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne).
- Ajouter 0,0931 g d'EDTA (cela se traduira par une concentration de 5 mM final de l'EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc; Phillipsburg, NJ).
- Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 1N.
- Réglez le volume à 50 ml avec de phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) (Mediatech Inc; Manassas, VA).
- Filtrer la solution à travers une membrane de nitrocellulose de 0,45 pm avec un appareil de filtration sous vide. Le tampon de conversion peut être conservé à 4 ° C pendant pas plus d'un mois.
4. L'amplification des souches de prion Utilisation PMCA
- Diluer la graine PMCA dans le substrat PMCA dans un rapport de 1:20 (mélange soit 5 ul de la graine PMCA et 95 ul du substrat PMCA) dans un tube PCR. Retirez et rangez une aliquote de 15 ul à -80 ° C pour le contrôle unsonicated, ce contrôle unsonicated sera utilisée pour quantifier l'amplification PrP Sc par la protéinase K (PK) digestion suivie par Western blot (WB) analyse. Une commande supplémentaire unsonicated peut être généré en plaçant une seconde aliquote 15 ul à 37 ° C pendant toute la durée de la réaction PMCA. Un minimum de trois répétitions est nécessaire à des fins statistiques.
- Sous réserve du reste de l'échantillon (70 pl) pour une tour de PMCA comme représenté sur la figure 1, partie A. Agiter chaque tube 5 h afin d'éviter la condensation de l'eau sur la coiffe en forme de dôme du tube de PCR.
- Tubes de l'échantillon doit être centrifugé et délicatement vortex (en faisant attention que la solution ne vont pas dans le bouchon en forme de dôme) avant d'ouvrir après toute procédure visant à assurer homogeneity et éviter toute contamination.
- Pour série PMCA (sPMCA) des souches période d'incubation courte (c.-à-HY TME, HaCWD ou 263K), diluer la matière traitée aux ultrasons dans un rapport de 1:20 en transférant 5 pl de l'échantillon soniqué de première ronde dans 95 ul de frais non infecté homogénat de cerveau (figure 2, partie B).
- Pour sPMCA de longues souches période d'incubation (c.-à-DY TME, 139H, 22CH, 22AH, ou ME7H), diluer la matière traitée aux ultrasons dans un rapport de 1:1 en transférant 50 ul de l'échantillon soniqué de première ronde dans 50 pl de frais non infecté homogénat de cerveau (figure 2, partie B).
- Retirez deux 15 aliquotes du mélange préalablement dilué soniqué (des étapes 4.4 ou 4.5) et stocker l'un d'eux à -80 ° C et l'autre à 37 ° C (solutions de contrôle unsonicated pour PMCA deuxième tour). Soumettre les restes d'une tour PMCA deux.
- Cette procédure peut être répétée indéfiniment. Dans notre laboratoire, nousont effectué jusqu'à quinze rounds PMCA, avec les propriétés de déformation reste inchangée.
- PK digérer les échantillons. Pour un type WB, mélanger 5 pl de PK 80 pg / ml à 5 pl de l'échantillon (cette solution a une concentration finale de PK 40 pg / ml) et incuber à 37 ° C pendant une heure. Ajouter 10 ul de tampon de charge de gel. Faire bouillir cette solution pendant 10 min. Laisser la solution refroidir et charger 10 pi dans le gel.
- Pour calculer le succès de l'amplification d'effectuer une analyse sur les échantillons WB PK-digérés pour estimer la quantité de PrP Sc amplifié en les comparant à deux, les contrôles unsonicated 20,21 graphique 2, partie C ou en un montant connu de PK-digérées recombinant PrP.
5. Éviter la contamination croisée
Les étapes critiques doivent être prises pour réduire au minimum la contamination croisée et l'apparition de faux positifs dus à la formation de novo de produits résistants à la protéase.
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Representative Results
Amplification cyclique protéine repliement (PMCA) est utilisée pour amplifier la PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24. Un succès PrP Sc amplification est démontré par une augmentation de l'intensité des bandes sur Western blot de la protéine prion PK-résistante (migration entre 19 et 30 kDa pour souches de prion de hamster dérivés), comme illustré à la figure 3. L'augmentation de l'intensité de la bande après PMCA indique l'amplification de la matière résistant à la PK-PrP Sc. Réussite de l'amplification de la protéine prion de hamster dérivé, HaCWD et DY TME, est montré dans l'analyse de la figure 3 WB en comparant les intensités des bandes avant (lignes 5 et 7) et après (lignes 4 et 6) PMCA.
PK digestion de la PrP Sc suivie d'une analyse WB montre une bande supérieure, moyenne et inférieure correspondant à la protéine prion di-, mono-, et non glycosylée, respectivement. Certaines souches de prions peuvent être différenciés par leurs élémentsmobilité ctrophoretic. Par exemple, il ya une différence de deux kDa de la migration entre le HaCWD et les souches DY prions TME. (Figure 3, lignes 1 et 2, respectivement).
Une haute fidélité PrP Sc amplification est réalisée par la PMCA 1, 7, 12, 19, 23, 24. Cette haute fidélité dans l'amplification PMCA est observé par une migration électrophorétique similaire des souches de prion PMCA-amplifiées (HaCWD et DY TME) par rapport à leurs semences correspondantes (Figure 3; pistes 1 & 2 & 4 et 6 pour HaCWD et DY TME, respectivement).
Si aucune contamination croisée ou de novo PrP Sc formation se produit, l'analyse d'échantillons simulés WB PMCA contrôle doit rester clair après digestion PK (figure 3, pistes 8 et 9).
Figure 1. Pour éviter la condensation de l'eau, un aquarium régulière de la chaleur-pad est placé au-dessus du couvercle de la corne de microplaques (partie A). Un appareil à ultrasons nouvelle marque doit bénéficier d'un période de rodage de sonication continue pendant environ deux mois. Le panneau B montre l'érosion de la corne de titane microplaque après la période de rodage. Panneau C montre une disposition possible des barrettes de tubes PCR qui permettrait à un traitement aux ultrasons optimale des échantillons.
Figure 2. Diagramme de la PMCA (panneau A), sPMCA (panneau B), et la Banque mondiale analyse (partie C). PrP Sc est la graine et le PMCA homogénat de cerveau infecté (ONU BH) est le substrat PMCA. La quantification de la PrP Sc amplifié pour chaque tour PMCA est obtenue en divisant l'intensité de bande après PMCA par son intensité bande correspondant avant PMCA.
Figure 3. Western blot de PK-digéré HaCWD et DY souches TME prions de hamster dérivés. PrP Sc est détectée en utilisant 3F4 anticorps anti-prion. L'analyse de la Banque mondiale montre l'abondance (intensité blot) et la mobilité électrophorétique de la PrP Sc. PMCA réactions ont été ensemencées avec un homogénat de cerveau de hamsters infectés soit avec le HaCWD (voies 4-5) ou DY TME (voies 6-7) agents. Les échantillons qui ont subi PMCA (PMCA +) montrent une augmentation de l'abondance PrP Sc par rapport à leurs non amplifiées (PMCA -) témoin (comparer les pistes 5 à 4 et 7 à 6). Il ya une différence de deux kDa dans la migration électrophorétique entre les protéines prions de HaCWD et DY TME (voies 1-2). Cette différence de migration est maintenu dans les échantillons PMCA générés en utilisant HaCWD et DY homogénats TME (lignes 4 et 6, respectivement). Réactions PMCA ensemencées avec le cerveau infecté (mock) homogénat ne parviennent pas à amplifier PrP Sc (piste 8). Les emplacements pour les 19 et 21 kDa marqueurs moléculaires sont indiqués à gauche de l'écran.
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Discussion
Les défis de amplification protéines prions infectieuses sont les longues périodes d'incubation et les frais de dans des expériences in vivo. La technique PMCA est un moyen rentable pour amplifier les prions infectieux. Plusieurs laboratoires ont confirmé la capacité de PMCA avec précision amplifier souches de prion in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.
Les maladies à prions peuvent être transmis entre les espèces. Bessen et Marsh ont effectivement inoculé hamsters avec l'encéphalopathie transmissible du vison, qui a produit deux souches de prion de hamster distinctes dérivés 5. Dans une étude élégante, spécifié et ses collègues sPMCA utilisé pour amplifier la souris dérivée de souche de prion, RML, en utilisant des souris transgéniques exprimant la PrP C cervidé (Tg (CerPrP) 1536 + / -) comme substrat PMCA. L'apparition rapide de la maladie a été observée après inoculation de Tg (CerPrP) 1536 + / - avec le matériel adapté PMCA 12. De même, Kurt et al. Ont pu amplifiermaladie du dépérissement chronique (CWD), une maladie à prion chez les cervidés, en utilisant non cervidés espèces substrat PMCA 15. Ces données suggèrent que la barrière d'espèce dans les maladies à prions peuvent être contournés in vitro par PMCA.
Bessen et Marsh ont montré que court le hamster souche période d'incubation, HY TME, a rapidement une accumulation de PrP Sc par rapport à son homologue d'incubation longue période, DY TME 3, 5. De même, la corrélation entre la période d'incubation et le taux d'accumulation est observée après PMCA dans plusieurs souches de prion de hamster dérivés de 1, 23, 24.
Le taux d'amplification est une propriété intrinsèque de chaque souche. PMCA a été utilisé pour quantifier ce taux d'amplification. Ayers et al. Ont pu calculer un nombre sans unité, appelé coefficient d'amplification, qui représente le taux d'amplification d'une souche de prion de hamster dérivée donnée 1.
Prionsouches peuvent interférer les uns avec les autres quand ils sont présents dans le même hôte. La présence d'une souche longue période d'incubation peut prolonger la période d'incubation ou même bloquer la capacité d'une souche courte période d'incubation de provoquer une maladie. Cette extension de la période d'incubation est appelé interférence souche. Interférences souche a été observé chez les souris et les hamsters 10 22. Bartz et ses collègues ont utilisé PMCA à étudier les interférences souche de prion chez le hamster. Leurs résultats montrent que les expériences PMCA en corrélation avec les résultats d'une expérience similaire in vivo 22, 23.
Comme il ya un niveau relativement faible de la PrP Sc en dehors du système nerveux central, les prions ne peut être diagnostiqué avec précision post-mortem par la dissection du cerveau suivie par immunohistochimie. PMCA peut être utilisé comme outil de diagnostic, car il a montré une grande capacité d'amplifier des quantités infimes de PrP Sc 7, même à partir de l'urine sampl hamsteres 11.
Le prion est capable de résister à des conditions environnementales difficiles et restent infectieux 16,17. Cependant, la quantité de PrP Sc dans l'environnement est trop petit pour être détecté en utilisant des techniques classiques telles la Banque mondiale. PMCA a été utilisé pour amplifier et de calculer le montant approximatif de la PrP Sc de l'environnement, tels que le sol et l'eau 16, 17, 20, 21.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Vesper Fe Marie Ramos pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06-01 et RR17417 G20RR024001) et l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies (2R01 NS052609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 | |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 | |
| Tenbr–ck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 | |
| Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 | |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 | |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 | |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV | |
| Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 | |
| Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
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