Proteine ​​ciclica Amplificazione misfolding di prioni

Summary

Misfolding amplificazione proteina ciclica (PMCA) è un test in vitro per lo studio della conversione prionica e barriere deformazione e specie. Può anche essere usato come un test di rilevazione prione.

Abstract

I prioni sono gli agenti infettivi che causano l'encefalopatia inevitabilmente fatale spongiforme trasmissibile (TSE) negli animali e nell'uomo ^9,18. La proteina prionica ha due isoforme distinte, non infettiva ospitante proteina codificata (PrP ^C) e la proteina infettiva (PrP ^Sc), una isoforma anormalmente piegato ^{PrP-C 8.}

Una delle sfide di lavorare con agenti prioni è il lungo periodo di incubazione prima dello sviluppo dei sintomi clinici dopo l'inoculazione ospite ^13. Questo mandato tradizionalmente lunghi e costosi studi di saggi biologici animali. Inoltre, le proprietà biochimiche e biofisiche di PrP ^Sc sono poco caratterizzati per la loro particolare conformazione e gli stati di aggregazione.

^PrPSc può seme della conversione della PrP ^{C e} PrP ^Sc in vitro ^14. PMCA è una tecnica in vitro che prende ADVAntage di questa capacità con cicli di sonicazione e di incubazione per la produzione di grandi quantità di PrP ^Sc, ad un ritmo accelerato, da un sistema che contiene una quantità eccessiva di PrP ^C e piccole quantità di seme PrP ^{Sc 19.} Questa tecnica ha dimostrato di ricapitolare in modo efficace la specificità di specie e la tensione di PrP ^Sc conversione da PrP ^C, per emulare ceppo interferenze prioni, e di amplificare livelli molto bassi di PrP ^Sc da tessuti infetti, fluidi, e campioni ambientali ^{6,7,16, 23.}

Questa carta dettagli del protocollo di PMCA, comprese le raccomandazioni per minimizzare la contaminazione, la generazione di risultati coerenti, e quantificare tali risultati. Discutiamo anche diverse applicazioni PMCA, compresa la produzione e la caratterizzazione dei ceppi di prioni infettivi, ceppo interferenza prione, e l'individuazione dei prioni nell'ambiente.

Protocol

1. Preparazione dell'apparecchiatura

1. Utilizzare un 3000 Misonix o Misonix 4000 sonicatore (Farmingdale, NY) collegato ad un bagno di Thermo Electron Neslab EX-7 acqua (Newington, NH) per mantenere una temperatura costante di 37 ° C. Sonicare i campioni in 200 ml a pareti sottili strisce di provette PCR con tappi a cupola ottenuti da Thermo Scientific (Waltham, MA).
2. Un sonicatore nuovo richiede un periodo di "rodaggio" di funzionamento continuo ^9. A due mesi il periodo di rodaggio è costituito da un 40-secondo scoppio sonicazione e 10 minuti cicli di incubazione con il livello di ampiezza impostato su 10. Si dovrebbero osservare erosione tutta la superficie della micropiastra titanio tromba (figura 1, pannello B). L'acqua che circola sarà bianca, torbida, a causa dell'erosione della micropiastra titanio corno. Sostituire questa acqua al giorno.
3. L'amplificazione di PrP ^Sc varierà in tutto il corno micropiastra. La migliore efficienza di amplificazione PrP ^Sc può essere ottenuto entroun raggio di 5 cm dal centro del corno micropiastra (vedi figura 1, pannello C).
4. Un giro di PMCA consiste 144 cicli. Ogni ciclo è composto di 5 sonicazione secondi e 10 minuti di incubazione. Ciò richiederà a circa 24 ore per ogni turno di PMCA.
5. La potenza della sonicazione, visualizzata sul pannello di controllo del sonicatore, la varia con il numero di provette PCR presenti nel rack del sonicatore e la temperatura dell'acqua circolante dal bagno. Garantire che l'acqua è equilibrata a 37 ° C, e non riempire più del 30% del portaprovette del sonicatore (figura 1, pannello C). Allargare le provette PCR tramite la sirena micropiastra. Avere almeno una fila di spazio vuoto tra le strisce di provette PCR e permettono non più di quattro tubi collegati insieme per striscia (figura 1, pannello C).
6. La forza di sonicazione è fondamentale per una amplificazione di successo ceppo prione. Mentre sonicating, regolare l'ampiezza di avere una potenzacompresa tra 155 ~ 170 watt. Nel nostro laboratorio il livello di potenza è impostato su sei e sette per il 3000 Misonix Misonix e 4000, rispettivamente.
7. Usare acqua distillata nel bagno d'acqua per evitare l'accumulo di macchie d'acqua dura. Sostituire questo settimanale acqua. Durante i cicli di incubazione e sonicazione, condensa si verifica all'interno del coperchio corno micropiastra. Per evitare la formazione di condensa, allegare un piccolo pad termico acquario all'inizio della scatola contenitore del sonicatore come mostrato in figura 1, il pannello A.

2. Preparazione dei campioni

1. Tutte le procedure che coinvolgono animali sono state approvate dal Animal Care Università Creighton istituzionale e uso Comitato e rispettare la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Prima di qualsiasi raccolta del tessuto, l'animale deve essere anestetizzati e perfusi con transcardiaca ghiacciata fosfato soluzione salina tamponata con 5 mM EDTA a pH 7,4 per rimuovere il sangue dal cervello ed evitare l'inibizione dellaReazione PMCA di sangue ^7. Raccogliere tessuti animali rapidamente usando tecniche asettiche e dispongono di strumenti di dissezione dedicati per ogni ceppo del prione. Dopo la dissezione, posizionare il tessuto in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, flash congelare il ghiaccio secco, e conservarlo a -80 ° C fino omogeneizzazione.
2. Per preparare il substrato PMCA (PrP ^C) soluzione, omogeneizzare un cervello infetto criceto (ONU BH) per un 10% peso / volume (w / v) con soluzione di tampone ghiacciato di conversione (vedere parte 3) utilizzando una mola tessuto Tenbroeck. Mentre omogeneizzazione, fare attenzione a non far entrare aria all'interno della smerigliatrice per evitare eccessiva formazione di schiuma della soluzione. Chiarire la soluzione per centrifugazione a 500 xg per 30 sec e un'aliquota del surnatante in provette per microcentrifuga 1,5 ml. Conservare a -80 ° C fino ad ulteriore utilizzo.
3. Per preparare il seme PMCA (PrP ^Sc) soluzione, omogeneizzare un materiale infettivo (linfonodi cervello, milza, altri tessuti, o suolo contaminato) ad un 10% w / v soluzione con wate ghiacciatar e aliquota della soluzione in 0,6 ml microprovette. Conservare a -80 ° C fino ad ulteriore utilizzo.

3. Preparazione del buffer di conversione

1. Pesare 0,5093 g di Triton X-100 in un pallone tarato da 50 ml (risultato una concentrazione finale di 1% Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Germania).
2. Aggiungere un completo proteasi Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania).
3. Aggiungere 0,0931 g di EDTA (questo si tradurrà in una concentrazione finale di 5 mM EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, NJ).
4. Regolare il pH a 7,4 con NaOH 1N.
5. Regolare il volume di 50 ml con fosfato di Dulbecco Buffered Saline (DPBS) (Mediatech Inc., Manassas, VA).
6. Filtrare la soluzione attraverso membrana da 0,45 micron nitrocellulosa con un apparato di filtrazione sotto vuoto. Il buffer di conversione può essere conservato a 4 ° C per non più di un mese.

4. L'amplificazione dei ceppi di prioni tramite PMCA

1. Diluire il seme PMCA nel substrato PMCA con un rapporto di 01:20 (mix ossia 5 microlitri del seme PMCA e 95 pl di substrato PMCA) in una provetta PCR. Rimuovere e conservare una aliquota 15 microlitri a -80 ° C per il controllo unsonicated; questo controllo unsonicated verrà utilizzato per quantificare l'amplificazione PrP ^Sc via proteinasi K (PK) digestione seguita da Western blot (WB) analisi. Un ulteriore controllo unsonicated potrebbe essere generato ponendo una seconda aliquota di 15 microlitri a 37 ° C per tutta la durata della reazione PMCA. Un minimo di tre ripetizioni è richiesto per fini statistici.
2. Oggetto del resto del campione (70 microlitri) di un ciclo di PMCA come rappresentato in figura 1, pannello A. Agitare tubi ogni 5 ore per evitare la formazione di condensa sul coperchio a cupola del tubo PCR.
3. Provette del campione deve essere centrifugati e delicatamente vortex (facendo attenzione che la soluzione non vanno nel tappo a cupola) prima di aprire dopo ogni intervento per garantire la omogenizzazioneeneity ed evitare potenziali contaminazioni.
4. Per seriale PMCA (sPMCA) di ceppi brevi periodo di incubazione (cioè HY TME, HaCWD o 263K), diluire il materiale sonicata in un rapporto di 01:20 trasferendo 5 microlitri del campione da sonicato rotonda in 95 pl di uninfected fresca omogenato cerebrale (Figura 2, pannello B).
5. Per sPMCA di ceppi lungo periodo di incubazione (cioè DY TME, 139H, 22CH, 22AH, o ME7H), diluire il materiale sonicata in un rapporto di 1:1, trasferendo 50 microlitri del campione da sonicato rotonda in 50 pl di uninfected fresca omogenato cerebrale (Figura 2, pannello B).
6. Rimuovere due aliquote da 15 pl della miscela precedentemente diluito con ultrasuoni (passi da 4,4 o 4,5) e memorizzare uno di loro a -80 ° C e l'altro a 37 ° C (soluzioni di controllo unsonicated per PMCA round). Sottoporre i resti di un giro PMCA due.
7. Questa procedura può essere ripetuta indefinitamente. Nel nostro laboratorio, abbiamohanno effettuato fino a quindici giri PMCA, con le proprietà di deformazione è rimasto immodificato.
8. PK digerire i campioni. Per una tipica WB, mescolare 5 ml di PK 80 ug / ml a 5 l di campione (questa soluzione avrà una concentrazione finale di PK 40 mcg / ml) e incubare a 37 ° C per un'ora. Aggiungere 10 ml di tampone di gel carico. Bollire questa soluzione per 10 min. Lasciate raffreddare la soluzione e caricare 10 microlitri nel gel.
9. Per calcolare il successo di amplificazione eseguire un'analisi WB sulle PK-digerito campioni per stimare la quantità di amplificato PrP ^Sc confrontandole con uno, i controlli unsonicated ^20,21 Figura 2, Pannello C o in valori di PK-digerito ricombinante PrP.

5. Evitare contaminazione incrociata

Passaggi critici devono essere prese per ridurre al minimo la contaminazione incrociata e l'insorgenza di falsi positivi dovuti alla formazione de novo di prodotti resistenti proteasi.

Utilizzare un set dedicato di strumenti di dissezione (cioè pinze, pinzette, forbici) per la raccolta del campione per ogni ceppo del prione.

Prima di omogeneizzazione cervelli infetti da utilizzare come substrato PMCA, pulire le pipette con 1% di candeggina. Immergere il sonicatore di portaprovette PCR, omogeneizzatori tessuti, PCR e scaffalature di stoccaggio tubo con 1% di candeggina per 10 minuti e risciacquare abbondantemente con acqua distillata.

Coprire l'area di lavoro con una nuova Versi-Dry Soaker Lab ogni volta che un nuovo campione deve essere omogeneizzato, un nuovo esperimento PMCA deve essere preparata, o quando aliquotandolo tra un round sPMCA.

Utilizzare guanti nuovi di volta in volta nuovi campioni sono trattati (in particolare durante il trasferimento di aliquote tra un round sPMCA).

Utilizzare raffiche brevi sonicazione per ogni ciclo PMCA. Cicli su 5 sonicazione sec combinata con 10 minuti di incubazione è sufficiente per amplificare prioni senza generare de novo ^{PrPSc 1,20,21,23,24.} Come altri laboratori hanno mostrato, aumentando latempo di sonicazione, aumentando l'ampiezza sonicazione, e aumentando il numero di cicli PMCA aumenta la probabilità di PrP ^Sc de novo formazione ^2.

Representative Results

Misfolding amplificazione proteina ciclica (PMCA) è utilizzato per amplificare PrP ^Sc in vitro ^{7, 12, 14, 19, 24.} Un successo PrP ^Sc amplificazione è indicato da un aumento di intensità banda su Western blot della PK-resistente proteina prionica (migrazione tra 19 e 30 kDa per criceto derivati ​​ceppi di prioni) come mostrato in Figura 3. L'aumento della sua intensità band dopo PMCA indica amplificazione del PK-materiale resistente ^PrPSc. Avvenuta amplificazione del criceto derivato proteina prionica, HaCWD e DY TME, è mostrato nell'analisi WB di figura 3 confrontando le intensità banda prima (corsie 5 e 7) e dopo (corsie 4 e 6) PMCA.

Digestione PK di PrP ^Sc seguita da analisi WB mostra una banda superiore, centrale e inferiore corrispondente alla proteina prionica di-, mono-, e non glicosilata, rispettivamente. Alcuni ceppi di prioni possono essere differenziati per la loro elemobilità ctrophoretic. Ad esempio, vi è un due-kDa differenza di migrazione tra l'HaCWD e DY ceppi di prioni TME. (Figura 3, corsie 1 e 2, rispettivamente).

Una alta fedeltà PrP ^Sc amplificazione è raggiunto dalla PMCA ^{1, 7, 12, 19, 23, 24.} Questa fedeltà ad alto contenuto di amplificazione PMCA è osservato da una migrazione simile elettroforetica delle PMCA-amplificati ceppi di prioni (HaCWD e DY TME) rispetto ai loro semi corrispondenti (figura 3; corsie 1 e 4 e 2 e 6 per HaCWD e DY TME, rispettivamente).

Se non contaminazione incrociata o de novo PrP ^Sc formazione si verifica, analisi WB di finti campioni di controllo PMCA deve rimanere trasparente dopo la digestione PK (Figura 3, corsie 8 e 9).

Figura 1. Per evitare la formazione di condensa, un acquario regolare calore-pad è posto sopra il coperchio del corno micropiastra (pannello A). Un sonicatore nuovo dovrebbe essere concesso un periodo di rodaggio di sonicazione continuo per circa due mesi. Pannello B mostra l'erosione sulla micropiastra titanio corno dopo il periodo di rodaggio. Pannello C illustra una possibile configurazione di strisce di provette PCR che permetta un ottimale sonicazione dei campioni.

Figura 2. Diagramma di flusso per PMCA (pannello A), sPMCA (pannello B), e WB analisi (pannello C). ^PrPSc è il seme PMCA e l'omogeneizzato cervello non infetto (ONU BH) è il substrato PMCA. La quantificazione del amplificato PrP ^Sc per ogni turno PMCA si ottiene dividendo l'intensità band dopo PMCA per la sua intensità banda corrispondente prima PMCA.

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Figura 3. Western blot di PK-digerito HaCWD e DY TME criceto derivati ​​da ceppi di prioni. PrP ^Sc viene rilevato utilizzando 3F4 anti-prione anticorpo. L'analisi della Banca Mondiale rileva una forte presenza (intensità blot) e la mobilità elettroforetica di ^PrPSc. Le reazioni sono state seminate PMCA con omogenato cerebrale di criceti infetti o con il HaCWD (corsie 4-5) o DY TME (corsie 6-7) agenti. I campioni che hanno subito PMCA (PMCA +) mostrano un aumento nell'abbondanza PrP ^Sc rispetto ai loro non amplificati (PMCA -) controlli (confrontare corsie 5 a 4 e da 7 a 6). Vi è una differenza di due kDa nella migrazione elettroforetica tra le proteine ​​prioniche di HaCWD e DY TME (corsie 1-2). Questa differenza di migrazione è mantenuta nelle PMCA generati campioni utilizzando HaCWD e DY omogenati TME (corsie 4 e 6, rispettivamente). Reazioni PMCA seminati con il cervello non infetti (finto) omogeneizzato non amplificare PrP ^Sc (corsia 8). Le sedi per le 19 e 21 kDa marcatori molecolari sono indicate a sinistra del pannello.

Discussion

Le sfide di amplificazione proteine ​​prioniche infettive sono i periodi di incubazione lunghi e le spese in esperimenti in vivo. La tecnica PMCA è una soluzione economica per amplificare agenti prioni infettivi. Diversi laboratori hanno confermato la capacità di PMCA di amplificare accuratamente ceppi di prioni in vitro ^{7, 9, 12, 14, 19,24.}

Malattie da prioni possono essere trasmessi tra le specie. Bessen e Marsh sono effettivamente inoculato criceti con encefalopatia trasmissibile del visone, che ha prodotto due distinte criceto derivati ​​da ceppi di prioni ^5. In uno studio elegante, lo dice e collaboratori sPMCA utilizzato per amplificare il mouse-ceppo derivato prione, RML, utilizzando topi transgenici che esprimono cervide PrP ^C (Tg (CerPrP) 1536 + / -) come substrato PMCA. Una rapida insorgenza della malattia è stata osservata dopo l'inoculazione del Tg (CerPrP) 1536 + / - con il materiale PMCA-adattato ^12. Analogamente, Kurt et al. Erano in grado di amplificaredeperimento malattia cronica (CWD), una malattia da prioni nei cervidi, utilizzando non cervidi specie PMCA substrato ^15. Questi dati suggeriscono che barriera di specie nelle malattie da prioni può essere aggirato in vitro via PMCA.

Bessen e Marsh hanno dimostrato che il ceppo criceto breve periodo di incubazione, HY TME, ha un rapido accumulo PrP ^Sc rispetto al suo omologo lungo periodo di incubazione, DY TME ^{3, 5.} Analogamente, questa correlazione tra il periodo di incubazione e il tasso di accumulo viene osservata dopo PMCA in diversi criceto derivati ​​ceppi di prioni ^{1, 23, 24.}

Il tasso di amplificazione è una proprietà intrinseca di ciascun ceppo. PMCA è stato utilizzato per quantificare il tasso di amplificazione. Ayers et al. Erano in grado di calcolare un numero adimensionale, denominato coefficiente di amplificazione, che rappresenta il tasso di amplificazione per un dato criceto-ceppo derivato prione ^1.

Prionceppi possono interferire con l'altro quando presenti nello stesso host. La presenza di un ceppo lungo periodo di incubazione può estendere il periodo di incubazione o anche bloccare la capacità di un ceppo breve periodo di incubazione di provocare malattie. Questa estensione nel periodo di incubazione è chiamato interferenza ceppo. Interferenze ceppo è stato verificato in ¹⁰ topi e criceti ^22. Bartz e collaboratori hanno usato per studiare PMCA ceppo interferenze prioni nei criceti. I loro risultati mostrano che gli esperimenti PMCA correlano con i risultati di un esperimento simile in vivo ^{22, 23.}

Poiché vi è un livello relativamente basso di PrP ^Sc fuori del sistema nervoso centrale, prioni possono essere accuratamente diagnosticati post-mortem tramite dissezione del cervello seguita da immunoistochimica. PMCA può essere usato come strumento diagnostico, avendo dimostrato una grande capacità di amplificare piccole quantità di PrP ^{Sc 7,} anche da sampl urine cricetoes ^11.

L'agente prione è in grado di resistere a condizioni ambientali difficili e rimanere infettive ^16,17. Tuttavia, la quantità di PrP ^Sc nell'ambiente è troppo piccola per essere rilevata utilizzando tecniche convenzionali quali WB. PMCA è stato utilizzato per amplificare e calcolare la quantità approssimativa di PrP ^Sc l'ambiente, come il suolo e l'acqua ^{16, 17, 20, 21.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbr–ck Tissue Grinder	Kontes	885000-0007
Neslab EX-7 Water Bath	Thermo Electron	Neslab EX-7
0.2 ml PCR Tube Strips	Thermo Scientific	AB-0451
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-100ML
Complete Protease Inhibitor	Roche	11 697 498 001
EDTA	J.T. Baker	4040-00
DPBS	Mallinckrodt Baker Mediatech	21-031-CV
Versi-Dry Lab Soakers	Fisher Scientific	14 206 28
Repti Therm Heater	Zoo Med Laboratories, Inc.	RH-4