Белки неправильного сворачивания Циклические Усиление Прионы

Summary

Белки неправильного сворачивания циклической амплификации (PMCA) является в пробирке анализа для изучения преобразования прионных и деформаций и виды барьеров. Она также может быть использована в качестве теста обнаружения прионов.

Abstract

Прионы инфекционных агентов, которые вызывают неизбежно смертельный передающийся губчатой ​​энцефалопатии (TSE) у животных и человека ^9,18. Прионных белков имеет два различных изоформ, неинфекционные хост-кодируемого белка (PrP ^C) и инфекционные белки (PrP ^Sc), неправильно сложенные изоформы PrP ^{C 8.}

Одна из проблем работы с прионных агентов длительный инкубационный период до развития клинических симптомов после прививки хозяин ^13. Это традиционно поручил длительного и дорогостоящего исследования на животных биопроб. Кроме того, биохимических и биофизических свойств ^PrPSc, плохо характеризуется из-за их необычного экстерьера и агрегации государства.

^PrPSc, может семена превращение PrP ^C в ^PrPSc, в пробирке ^14. PMCA находится в технике пробирке, которая принимает ADVAntage этой возможностью использования ультразвука и инкубации циклов, чтобы производить большое количество ^PrPSc, в ускоренном темпе, с системой, содержащей избыточное количество PrP ^C и незначительное количество семян ^{PrPSc, 19.} Этот метод оказался эффективным повторять вида и штамма специфику ^PrPSc, преобразование из PrP ^C, подражать вмешательства прионных деформации, а для усиления очень низким уровнем ^PrPSc, из инфицированных тканей, жидкостей и проб окружающей среды, ^{6,7,16, 23.}

Эта статья подробно протокол PMCA, включая рекомендации по минимизации загрязнения, создавая устойчивые результаты, и количественной оценки этих результатов. Мы также обсудим несколько приложений PMCA, в том числе производства и характеристика инфекционного штамма приона, интерференция прионных деформации и обнаружения прионов в окружающей среде.

Protocol

1. Подготовка оборудования

1. Используйте Misonix 3000 или 4000 Misonix ультразвукового (Farmingdale, Нью-Йорк), подключенных к Thermo Electron Neslab EX-7 водяной бане (Newington, Нью-Гэмпшир), чтобы сохранить постоянную температуру 37 ° C. Разрушать ультразвуком образца в 200 мкл тонкостенных труб ПЦР полосы с куполообразной крышки получены от Thermo Scientific (Waltham, MA).
2. Новый ультразвукового требует "обкатки" период непрерывной работы ^9. Двухмесячного перерыва в период состоит из 40-сек взрыв ультразвуком и 10-минутных циклов инкубации с амплитудой уровень установлен на 10. Следует заметить эрозию всей поверхности титана планшет рога (рис. 1, группа В). Циркулирующей воды будет выглядеть белой мутной из-за эрозии титана планшет рога. Заменить эту воду ежедневно.
3. Усиление ^PrPSc, будет меняться на протяжении рога микропланшетов. Лучше ^PrPSc, усиление эффективности могут быть получены врадиусом 5 см от центра планшет рога (см. рисунок 1, панель C).
4. Один цикл состоит PMCA 144 циклов. Каждый цикл состоит из 5 с ультразвуком и 10 мин инкубации. Это будет примерно влечет за собой до 24 часов в раунде PMCA.
5. Выходная мощность ультразвука, отображаемые на панели управления ультразвукового автора, варьируется в зависимости от количества труб ПЦР присутствуют в стойку ультразвукового и температуры циркулирующей воды из ванны. Убедитесь, что вода находится в равновесии при 37 ° C, и не заполнять более 30% труб стойки ультразвукового (Рисунок 1, панель C). Распространение ПЦР пробирок через рог микропланшетов. Есть по крайней мере одна строка пустое пространство между ПЦР стирпов и позволит не более четырех труб, соединенных вместе в полосе (рис. 1, панель C).
6. Сила ультразвуком имеет решающее значение для успешного усиления штамм прионов. В то время как ультразвуком, регулировки амплитуды иметь выходную мощностьв диапазоне между 155 ~ 170 Вт. В нашей лаборатории уровень мощности установлен на шесть и семь для Misonix 3000 и Misonix 4000, соответственно.
7. Используйте дистиллированную воду в ванну с водой, чтобы избежать накопления жесткие пятна воды. Заменить эту воду раз в неделю. Во время инкубации и ультразвуком циклов, конденсации воды будет происходить внутри крышки рога микропланшетов. Чтобы избежать конденсации, приложите небольшое площадку тепла аквариума в верхнюю часть корпуса коробки ультразвукового, как показано на рисунке 1, панель A.

2. Подготовка образцов

1. Все процедуры, связанные с животными были одобрены Университет Крейтон Институциональные уходу и использованию животных комитета и соблюдать Руководство по уходу и использованию лабораторных животных. Перед любой ткани коллекции, животное должно быть под наркозом и transcardially перфузировались использованием ледяной фосфатный буферный солевой раствор с 5 мМ ЭДТА при рН 7,4 для удаления крови от головного мозга и избежать торможенияPMCA реакции крови ^7. Сбор ткани животных быстро с использованием асептических условиях и иметь специальные инструменты диссекции для каждого прионных напряжения. После вскрытия, поместите ткань в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, флэш заморозить его на сухом льду, и хранить его при температуре -80 ° C до гомогенизации.
2. Для приготовления субстрата PMCA (PrP ^C) раствор, гомогенизации неинфицированных мозг хомяка (ООН BH) до 10% вес / объем (вес / объем) раствор с ледяным буфером преобразования (см. часть 3) с помощью мясорубки Tenbroeck ткани. В то время гомогенизации, будьте осторожны, чтобы не получить воздух внутри мясорубки, чтобы избежать чрезмерного вспенивания раствора. Уточнение решения путем центрифугирования при 500 мкг в течение 30 сек и аликвоты супернатанта в пробирки на 1,5 мл микроцентрифуге. Хранить при температуре от -80 ° C до дальнейшего использования.
3. Для подготовки семенного PMCA (PrP ^Sc) решение, гомогенизации инфекционный материал (головной мозг, селезенка, лимфатические узлы, другие ткани или загрязненной почвы) до 10% вес / объем раствора с ледяной водоснаг и аликвоты раствора в 0,6 мл пробирок микроцентрифуге. Хранить при температуре от -80 ° C до дальнейшего использования.

3. Подготовка преобразование буфера

1. Взвесить 0,5093 г тритона Х-100 в 50 мл мерную колбу (результат 1% конечной концентрации Тритон Х-100) (Sigma-Aldrich GmbH; Steinheim, Германия).
2. Добавить один полный ингибитор протеазы Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия).
3. Добавить 0,0931 г ЭДТА (это приведет к 5 мМ конечной концентрации ЭДТА) (Mallinckrodt Baker Инк; Phillipsburg, NJ).
4. Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью 1 н NaOH.
5. Регулировка громкости до 50 мл с фосфатом Дульбекко буферном растворе (DPBS) (Mediatech Инк; Manassas, VA).
6. Фильтр раствор через 0,45 мкм нитроцеллюлозные мембраны с аппаратом вакуумной фильтрации. Преобразование буфера можно хранить при температуре 4 ° С в течение не более одного месяца.

4. Усиление Prion штаммов Использование PMCA

1. Развести PMCA семян в грунт PMCA в соотношении 1:20 (например, смесь 5 мкл семян PMCA и 95 мкл субстрата PMCA) в ПЦР-пробирку. Удалите и храните в 15 мкл при температуре -80 ° С в течение unsonicated контроля; это unsonicated управления будет использоваться для количественного усиления ^PrPSc, с помощью протеиназы К (PK) пищеварение последующим Вестерн-блот (WB) анализа. Дополнительных unsonicated управления может быть создан путем размещения второй 15 мкл при 37 ° C в течение реакция PMCA. Не менее трех повторений требуется для статистических целей.
2. Тема оставшейся части образца (70 мкл) на один раунд PMCA, как показано на рисунке 1, Группа A. Шейк труб каждые 5 часов, чтобы избежать конденсации воды на куполообразной крышкой ПЦР-пробирку.
3. Трубы образца должна быть развернулся вниз и слегка встряхивают (будьте осторожны, что решение не идти в куполообразной крышкой) перед открытием после любой процедуры для обеспечения homogeneity и избежать возможных загрязнений.
4. Для последовательного PMCA (sPMCA) из короткий инкубационный период штаммов (т. е. HY TME, HaCWD, или 263K), разбавленные ультразвуком материала в соотношении 1:20 путем перевода 5 мкл образца ультразвуком от раунде в 95 мкл свежей неинфицированных гомогената мозга (рис. 2, группа B).
5. Для sPMCA длинного инкубационного периода штаммов (т. е. DY TME, 139H, 22CH, 22AH, или ME7H), разбавить ультразвуком материала в соотношении 1:1 по передаче 50 мкл ультразвуком образца от раунде в 50 мкл свежей неинфицированных гомогената мозга (рис. 2, группа B).
6. Удалите два 15 мкл аликвоты из предварительно разбавив смесь ультразвуком (с шагом 4,4 или 4,5) и сохранить одну из них при -80 ° C, а другой при 37 ° C (unsonicated решений для управления PMCA втором раунде). Подвергать остатки на PMCA раунде.
7. Эта процедура может повторяться бесконечно. В нашей лаборатории мывыполнены до пятнадцати PMCA раундов, с механические свойства остаются неизменными.
8. PK переварить образцов. Для типичного ВБ, смешайте 5 мкл PK 80 мкг / мл до 5 мкл образца (это решение будет иметь конечной концентрации PK 40 мкг / мл) и инкубируют при 37 ° C в течение одного часа. Добавить 10 мкл буфера геля нагрузки. Кипятить это решение в течение 10 мин. Пусть решение остыть и загрузите 10 мкл в гель.
9. Для расчета успех усиления провести анализ ВБ по PK-переваривается образцы для определения суммы усиленного ^PrPSc, сравнивая их либо, unsonicated контроль ^20,21 рисунке 2, Группа C или в известные суммы PK-непереваренной рекомбинантных PrP.

5. Как избежать перекрестное загрязнение

Критические шаги должны быть предприняты для минимизации перекрестного загрязнения и появления ложных срабатываний за счет De Novo образования продуктов протеазы устойчивостью.

Используйте специальный набор инструментов рассечение (т.е. щипцы, пинцеты, ножницы) для отбора проб для каждого прионных напряжения.

Перед гомогенизации неинфицированных мозги, которые будут использоваться в качестве субстрата PMCA, протрите пипетки с 1% хлорной извести. Замочить ПЦР ультразвуком в трубе стойки, ткани гомогенизаторы, и ПЦР стойки трубы хранение с 1% отбеливателя в течение 10 минут и тщательно промыть дистиллированной водой.

Накройте рабочую зону с новым Versi-Dry Лаборатории Soaker каждый раз новый образец должен быть гомогенизируют, новый эксперимент PMCA должен быть подготовлен, или когда аликвоты между раундами sPMCA.

Используйте новые перчатки каждый раз новые образцы обрабатываются (особенно при передаче аликвоты между раундами sPMCA).

Используйте короткие всплески ультразвуком в течение каждого цикла PMCA. Циклы 5 сек в сочетании с ультразвуком 10 мин инкубации является достаточным для усиления прионы, не создавая заново ^{PrPSc, 1,20,21,23,24.} В других лабораториях, показали, что повышаетультразвуком время, увеличение амплитуды ультразвука, и расширение количества циклов PMCA увеличивает вероятность De Novo ^PrPSc, формирование ^2.

Representative Results

Белки неправильного сворачивания циклической амплификации (PMCA) используется для усиления ^PrPSc, в пробирке ^{7, 12, 14, 19, 24.} Успешное ^PrPSc, усиление показали увеличение интенсивности полосы на Западной блоттинга PK-устойчивых прионных белков (миграция между 19 и 30 кДа для хомяка полученные штаммы приона), как показано на рисунке 3. Увеличения его интенсивности полос после PMCA указывает усиление PK-стойкого материала ^PrPSc. Успешное усиления хомяка полученных прионных белков, HaCWD и DY TME, показано в анализе ВБ Рисунок 3 путем сравнения интенсивностей полос до (дорожки 5 и 7) и после (дорожки 4 и 6) PMCA.

PK переваривания ^PrPSc, с последующим анализом ВБ показывает, верхней, средней и нижней полосы, соответствующей ди-, моно-и негликозилированной прионных белков, соответственно. Некоторые штаммы приона могут быть дифференцированы по их элементовctrophoretic мобильности. Например, есть два кДа разницы в миграции между HaCWD и DY штаммов TME прионов. (Рис. 3, дорожки 1 и 2, соответственно).

Высокая точность ^PrPSc, усиление достигается за счет PMCA ^{1, 7, 12, 19, 23, 24.} Это высокая точность в усилении PMCA наблюдается аналогичным электрофоретической миграции PMCA усиленный прионных штаммов (HaCWD и DY TME) по сравнению с соответствующим семян (рис. 3; дорожках 1 и 4 и 2 и 6 для HaCWD и DY TME, соответственно).

Если нет перекрестного загрязнения или De Novo ^PrPSc, формирование происходит, ВБ анализа макета контрольных образцов PMCA должно оставаться ясным после PK пищеварения (рис. 3, полосы 8 и 9).

Рисунок 1. Чтобы избежать конденсации воды, регулярные аквариума тепло-панель находится над крышкой планшета рог (панели). Новый ультразвукового должно быть разрешено перерыв в период непрерывной обработки ультразвуком в течение примерно двух месяцев. Группа B показывает эрозии на титан планшет рога после перерыва в срок. Группа C показывает возможное расположение полос ПЦР трубку, которая позволила бы оптимально ультразвуком образцов.

Рисунок 2. Схема для PMCA (панели), sPMCA (группа B), и ВБ анализа (панель C). ^PrPSc, это семя PMCA и неинфицированных гомогената мозга (ООН BH) является субстратом PMCA. Количественной оценки усиленный ^PrPSc, для каждого PMCA круглый получается путем деления интенсивности полосы после PMCA по соответствующему интенсивность полосы до PMCA.

Ю.С. ">
Рисунок 3. Вестерн-блоттинга PK-переваривается HaCWD и DY TME хомяка полученных штаммов прионов. ^PrPSc, определяется с помощью 3F4 против прионных антител. Анализ Всемирного банка показывает изобилие (пятно интенсивности) и электрофоретической подвижности ^PrPSc. PMCA реакции высевают с гомогената мозга от хомяков инфицированы либо HaCWD (полосы 4-5) или DY TME (полосы 6-7) агентов. Образцы, которые прошли PMCA (PMCA +) показывают увеличение численности ^PrPSc, по сравнению с их неусиленных (PMCA -) управления (сравните дорожки 5 до 4 и 7, 6). Существует два кДа разница в электрофоретической миграции между прионных белков HaCWD и DY TME (дорожки 1-2). Эта разница в миграции сохраняется в PMCA генерируемых образцов с использованием HaCWD и DY TME гомогенатах (дорожки 4 и 6, соответственно). PMCA реакции засевают неинфицированных мозга (макет) гомогенат не в состоянии усилить PГР ^Sc (дорожка 8). Места для 19 и 21 кДа молекулярных маркеров указаны в левой части панели.

Discussion

Проблемы усиливающей инфекционных белков прионных являются длительные периоды инкубации и расходов в естественных условиях эксперименты. Техника PMCA является экономически эффективным средством для усиления инфекционных агентов прионов. Несколько лабораторий подтвердили способность PMCA точно усиливать прионных штаммов в ^{7 пробирке, 9, 12, 14, 19,24.}

Прионных заболеваний могут передаваться между видами. Бессен и Марш эффективно прививку хомяков с заразными энцефалопатии норка, которая произвела два различных хомяка полученных прионных штаммов ^5. В элегантном исследовании, указал и сотрудники использовали sPMCA для усиления мыши производных штамма приона, RML, с использованием трансгенных мышей, экспрессирующих cervid PrP ^C (Tg (CerPrP) 1536 + / -) в качестве субстрата PMCA. Быстрое начало болезни наблюдается после прививки Tg (CerPrP) 1536 + / - с PMCA адаптированный материал ^12. Точно так же, Курта и соавт. Были в состоянии усилитьхронические заболевания истощение (УХО), прионных болезней в cervids, с использованием не-cervid видов PMCA подложки ^15. Эти данные позволяют предположить, что видовой барьер в прионных болезней может быть обойден в пробирке с помощью PMCA.

Бессен и Марш показали, что короткий инкубационный период хомяка штамм, HY TME, имеет быстрое накопление ^PrPSc, по сравнению с его коллегой длинный инкубационный период, DY TME ^{3, 5.} Кроме того, эта корреляция между инкубационный период и скорость накопления наблюдается после PMCA в нескольких хомяков полученных прионных штаммов ^{1, 23, 24.}

Усиление курса является собственностью присущих каждой линии. PMCA была использована для количественной оценки этого усиления курса. Ayers и соавт. Смогли рассчитать безразмерные числа, называется коэффициентом усиления, который представляет собой скорость усиления для данного хомяка полученного штамма приона ^1.

Prionштаммы могут мешать друг другу, когда присутствуют в том же хосте. Присутствие долго штамм инкубационный период может продлить инкубационный период или даже блокировать способность короткого инкубационного периода деформации вызвать заболевание. Это расширение в инкубационном периоде, называется штаммом помех. Штамм вмешательство было показано, что происходит у мышей, хомяков ¹⁰ и ^22. Бартц и сотрудники использовали PMCA для изучения помех прионных напряжение в хомяков. Их результаты показывают, что PMCA экспериментов согласуются с результатами аналогичного эксперимента в ^{22 VIVO, 23.}

Поскольку существует относительно низкий уровень ^PrPSc, за пределами центральной нервной системы, прионы могут быть точно диагностированы посмертного вскрытия через мозг следуют иммуногистохимии. PMCA может быть использован в качестве диагностического инструмента, так как она показала большую возможность усиления незначительное количество ^{PrPSc, 7,} даже из мочи SAMPL хомякаES ^11.

Прионных агент способен выдерживать суровые условия окружающей среды и остаются инфекционные ^16,17. Тем не менее, количество ^PrPSc, в среду слишком мала, чтобы быть обнаружены с помощью обычных методов, таких ВБ. PMCA была использована для усиления и рассчитать приблизительное количество ^PrPSc, окружающей среды, таких как почва и вода ^{16, 17, 20, 21.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbr–ck Tissue Grinder	Kontes	885000-0007
Neslab EX-7 Water Bath	Thermo Electron	Neslab EX-7
0.2 ml PCR Tube Strips	Thermo Scientific	AB-0451
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-100ML
Complete Protease Inhibitor	Roche	11 697 498 001
EDTA	J.T. Baker	4040-00
DPBS	Mallinckrodt Baker Mediatech	21-031-CV
Versi-Dry Lab Soakers	Fisher Scientific	14 206 28
Repti Therm Heater	Zoo Med Laboratories, Inc.	RH-4