Summary
Dette papir detaljer hvordan du bruger kontinuerlig-flow hypoxi kamre til at skabe atmosfære med definerede koncentrationer af O
Abstract
Ilt er afgørende for alle metazoans at overleve, med en kendt undtagelse 1. Nedsat O 2 værelser (hypoxi) kan opstå under tilstande af sygdom, normal udvikling eller ændringer i de miljømæssige forhold 2-5. Forståelse af de cellulære signalveje, der er involveret i respons på hypoxi kan give ny indsigt i behandling strategier for forskellige humane patologier, fra slagtilfælde til kræft. Dette mål er blevet hæmmet i det mindste delvis af tekniske vanskeligheder i forbindelse med kontrolleret hypoksisk eksponering i genetisk modtagelige modelorganismer.
Nematoden Caenorhabditis elegans er velegnet som en model organisme til undersøgelse af hypoxisk reaktion, da det er let at dyrke og genetisk manipulation. Desuden er det muligt at studere cellulære reaktioner på specifikke hypoxiske O 2 koncentrationer uden forstyrrende virkninger, da C. elegans opnåelse O2 (og andre gasser) ved diffusion, i modsætning til et forenklet åndedrætsorganerne 6. Faktorer, der vides at være involveret i respons på hypoxi, er konserveret i C. elegans. Den faktiske respons på hypoxi afhænger af den specifikke koncentrationen af O2, der er til rådighed. I C. elegans, udsættelse for moderat hypoksi fremkalder en transkriptionel reaktion medieret høj grad af HIF-1, de stærkt konserverede hypoksi-inducerbar transkription faktor 6-9. c. elegans embryoer krav HIF-1 til at overleve i 5,000-20,000 ppm O2 7,10 . Hypoksi er en generel betegnelse for "mindre end normal O 2". Normoxi (normal O 2) kan også være svært at definere. Vi finder generelt rumluft, der er 210 tusind ppm O2 er normoxi. Imidlertid har det vist sig, at C. elegans har adfærdsmæssige præference for O 2-koncentrationer fra 5-12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. I larvae og voksne, HIF-1 handlinger for at forhindre hypoksi-induceret diapause i 5.000 ppm O 2 12. Imidlertid HIF-1 ikke spiller en rolle i reaktionen til lavere koncentrationer af O2 (anoxi, operationel definition <10 ppm O2) 13. I anoxi, C. elegans indgår en reversibel tilstand af suspenderet animation, hvor al mikroskopisk observerbare aktivitet ophører 10. Den kendsgerning, at forskellige fysiologiske reaktioner forekommer i forskellige forhold understreger vigtigheden af at have eksperimentel kontrol over den hypoxiske koncentrationen af O2.
Her præsenterer vi en metode til konstruktion og implementering af miljøkamre der producerer pålidelige og reproducerbare hypoxisk betingelser med veldefinerede koncentrationer af O 2. Den kontinuerlig metode sikrer hurtig ækvilibrering af kammeret og forøger stabiliteten af systemet. Derudover, gennemsigtighed ogtilgængelighed af kamrene muliggøre direkte visualisering af dyr blev udsat for hypoxi. Vi yderligere at demonstrere en effektiv metode til høst C. elegans prøver hurtigt efter udsættelse for hypoxi, hvilket er nødvendigt for at observere mange af de hurtigt-tilbageførte forandringer, der sker i hypoxi 10,14. Denne fremgangsmåde tilvejebringer en fundament, der let kan modificeres til individuelle laboratorie behov, herunder forskellige modelsystemer og forskellige gasser.
Protocol
1. Konstruktion af Miljøkamre
- Vælg den mindste rimeligt volumen af kammer nødvendig for omfanget af dit projekt. Kammeret skal være fremstillet af gas (O2) impermeabelt materiale. Pyrex krystallisering retter, Anaeropack kasser, eller store støbt akryl kasser (Ellard Instrumentation), kan anvendes. Vi har fundet, at 9 50 mm plader kan passe ind i en 100 x 50 Kimex krystallisation skål. Glasplader kan anvendes som låg for Pyrex krystallisation retter.
- Bor et hul i det valgte kammer og passer med en plastik Luer at slangen modhager montering (Cole Parmer). Fittings kan sikres ved rørfitting eller epoxy. Installere en tilsvarende fitting på den modsatte side af beholderen for at tillade gas at strømme ind og ud af kammeret. Hvis det er muligt, offset huller for at øge turbulent blanding.
- Få komprimeret gastanke med definerede O 2-koncentrationer (balanceret med N 2), der er certificeret standard for O 2 content eller for anoxiske betingelser, rent N2 (<10 ppm O2). Brug en automatisk afbryder-over regulatorer for mere langsigtede undersøgelser for at undgå en afbrydelse af iltindholdet i kamrene.
- Organismal respons på hypoxi har vist sig at være temperaturafhængigt 15. Ved at anbringe kammeret i en inkubator, kan forskellige temperaturer opretholdes. Temperaturer i en inkubator, kan være ujævn, og som sådan er det klogt at gøre brug af en temperatur datalogger konstant måle temperaturen inde i kammeret.
2. Tilslutning af gas til Miljøklagenævnet Afdeling
- For alle forbindelser, skal du bruge en ottendedel-tommer ydre diameter på rør forbundet med enten snapforbindelsesdele eller kompressionsfittings. Slangen skal være impermeabel og ikke reaktive med O2, såsom fluorineret ethylenpropylen (FEP) eller nylon (Cole Parmer). En skematisk den færdige konfiguration, se figur 1.
- Tilslut compressede gastanke til en flowkontrolanordning, såsom en masse strømningsregulator (Sierra Instruments) eller flowmeter (Aalborg). Sikre, at opstrøms tryk fra beholderen er i området af strømningen indretningen og slangen modhager fittings. To-trins regulatorer anvendes generelt, idet den anden fase indstilles til det ønskede tryk [se afsnit tre til valg af passende strømningshastighed]
- Hydrat gassen ved bobling gennem destilleret vand under anvendelse af en gas vaskeflaske med frittet cylinder, derefter direkte ind i en af de beslag på den miljøkammeret, der forlader den anden fitting åben gas udstødning (se figur 1). For kortvarige undersøgelser, beskytter gas hydrering mod plade udtørring, men luftfugtighed overvågning kan være nødvendig for langsigtede studier.
- Dow Corning Vakuum Fedt kan anvendes til at forsegle kammeret. Sted vægt på låget af kammeret for at sikre en lufttæt forsegling. For at bekræfte en tæt forsegling og tilstrækkelig strøm, holder en lille pulje af vand i håndfladen af yvores behandskede hånd til ud montering på kammeret og se efter bobler.
3. Valg Flow Rate
- Antages perfekt blanding, der er 90% gasudveksling af den gasformige atmosfære, hver gang volumenet af kammeret ændres (Ficks lov). For eksempel i en 100 cc kammer med en strømningshastighed på 100 cc / min vil den oprindelige huset luften i kammeret være erstattet med 90% af den ønskede gas efter 1 minut og vil asymptotisk nærmer fuldstændig bytning med 90% hvert minut derefter.
- Højere flowhastigheder og mindre beholdere vil nå den ønskede iltkoncentration hurtigere. Til 100 x 50 Kimex beholdere (400 cc), en strømningshastighed på 120 cc / min vil nå 99,9% udveksling i 10 minutter (3 udveksling). Denne strømningshastighed er egnet til de fleste iltforhold. Til vores viden har der ikke været en systematisk undersøgelse af, hvordan ændringshastigheden af O2 koncentration påvirker reaktionen i C. elegans.
- Orme udsat for hypoxiske betingelser, der almindeligvis undslippe overfladen af agarplader. At forhindre dette ved at placere en ring af palmitinsyre (10 mg / ml i ethanol) omkring kanten af pladerne. Den palmitinsyre kommer ud af opløsning som ethanol fordamper og danner en fysisk barriere. Palmitinsyreolier barrierer påvirker ikke antallet af æglægning, frugtbarhed eller levetid i C. elegans 16,17. Gravende ikke forekommer oftere i hypoxisk betingelser, er så yderligere forebyggende foranstaltninger generelt ikke påkrævet.
- Generer synkroniseret befolkninger ved blegning gravide voksne i en lille dråbe af alkalisk blegemiddel løsning på upodet nematodevækst medier (NGM) plader 18. I modsætning til standard stor batch hypochlorit blegemidler protokoller, pick 1-100 dyr i en dråbe blegemiddelopløsning på overfladen af en NGM plade derefter give blegemiddelopløsningen at absorbere ind i pladen
- Undgå at udsætte blegede embryoner til hypoxi, da dette kan reducere levedygtighed 13. At indsamle unge embryoer (2-4 celler), kan gravide voksne hakkes i en lille mængde af vand med et barberblad og embryoner flyttet til pladerne gennem munden pipette for efterfølgende eksponering for hypoksi.
- Generer synkroniseret befolkninger ved blegning gravide voksne i en lille dråbe af alkalisk blegemiddel løsning på upodet nematodevækst medier (NGM) plader 18. I modsætning til standard stor batch hypochlorit blegemidler protokoller, pick 1-100 dyr i en dråbe blegemiddelopløsning på overfladen af en NGM plade derefter give blegemiddelopløsningen at absorbere ind i pladen
- Forsegling i miljøkammeret. Kontrol dyr bør holdes i normoxi (hus luft) ved samme temperatur som behandles orme. Der er ingen observerbar forskel mellem prøverne efterlades i huset luft og de holdes i en identisk kammer med huset luft strømmer hen over dem. Initiere gasstrøm og opretholde eksponering for den ønskede tid. For at sikre ensartethed i rampe, skal du sørge forerstatter vandet i gassen vaskeflaske før eksponering.
- Til assay overlevelse af embryoner, ormene for at udvikle i 48 timer efter tilbagevenden til normal luft tillade, på hvilket tidspunkt de skal fjerde trin larver / dag voksne. Score for overlevelse, censurere de orme, der ikke kan redegøres for.
- At visualisere dyr udsat for hypoksi, flytte orme til en dråbe af M9 på en 22 mm 2 dækglas, og vendes på en pude af 2% agarose i M9 18. Hvis det er nødvendigt, levamisol (25 mM) eller natriumazid (10 mM) kan anvendes som bedøvelsesmiddel. Natriumazid og levamisol kan forvirre nogle bemærkninger på grund af toksicitet og skal velovervejet anvendes 19.
5. Hurtig Høst af Hypoxi-eksponerede Worms (Eksempel: forberedelse af prøver til HIF-1 vestlige Analysis)
Mange hypoxi-inducerede virkninger er hurtigt vendt på tilbagevenden til rumluft, herunder genoptagelsen af ægproduktion 12, fosforylering af mitose epitoperi embryogenese 13 og nedbrydning af HIF-1-protein 9,20. Hurtig isolation af dyr udsat for hypoksi er nødvendig for at opnå reproducerbare virkninger i disse tilstande. Med dette setup, kan dyrene høstes og fryses i flydende nitrogen på mindre end to minutter. Mens handskerum hypoxi kamre giver mulighed for manipulation af prøver i iltfrie forhold, deres omkostninger og praktisk for andre forhold end iltmangel begrænser deres anvendelighed.
- Grow Bristol N2 orme på 4 10 cm høj vækst (HG), plader, indtil et flertal af de orme er gravide voksne 18. Vask orme i et 15 ml konisk rør indeholdende en 1:5 alkalisk blegeopløsning og inkuberes med rotation, indtil orme begynder at opløses, ikke mere end 5 minutter 9. Vask orme tre gange med M9, spinning ned ved 1500 xg mellem hver vask uden bremsning.
- Plate blegede embryoner på 8 150 mm NGM plader og lad dem udvikle sig til L4 larver (ca. 48 timer for Bristol N2 ved 22 ° C).Flyt plader miljøkamre og udsættes for iltsvind (1.000 ppm, 5.000 ppm) og anoxiske (N2) betingelser for 4 timer. Eksponeringstider vil variere afhængigt af eksperimentelle design. Mens eksponering for hypoxi har en umiddelbar effekt på hastigheden af æglægning, to celle embryoner dør efter 16-18 timers eksponering 12. Med denne hypoxi kammer setup, er den nedre grænse for eksponering begrænset af antallet af atmosfæren udveksling nødvendige for at nå ligevægt.
- Mærk et 1,5 ml mikrofugerør, og en 15 ml konisk rør for hver eksperimentel prøve. Worms udsat for hypoxi er mere tilbøjelige til at klæbe til siderne af røret ved høst. For at forhindre dette sted 100 gl 1% natriumdodecylsulfat (SDS) i hver 15 ml konisk rør. Hvis SDS inhiberer nedstrøms anvendelser, bovint serumalbumin (BSA), kan anvendes til at forhindre klæbning. Rutinemæssig anvendelse af SDS eller BSA synes ikke at have en tydelig forskel. Tilsættes 50 ul 2x proteinbelastning farvestof (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol og enspor af bromphenolblåt i 30% glycerol (w / v)) til 1,5 ml mikrofugerør. En Dewar af flydende nitrogen klar.
- Tid trinene efter fjernelse af orme fra hypoxia og rekord. Fjern låget til hypoxiske kammer, tage en prøve plade, og forsegle kammeret. Bruge destilleret vand til at vaske ormene på et nylonfilter og derefter hældes i 15 ml koniske rør. Spin ormene ned i en desktop centrifuge ved 1500 xg i 15-20 sekunder med bremse.
- Anvender et vakuum til at fjerne det meste af supernatanten fra røret, der forlader sneglen pellet urørt.
- Ved hjælp af en pipette, ormen pellet bevæge sig i 50 pi til 1,5 ml mikrofugerør. Røret forsegles, og nedsænkes i flydende nitrogen.
- Gentages, indtil alle prøver er blevet isoleret. Følg disse procedurer for hus luft kontrolprøver for konsistens. Prøver kan opbevares ved -20 ° C.
6. Repræsentative resultater
Organismal virkninger hypoxi kan sesved at undersøge levedygtigheden til voksenalderen C. elegans (figur 2). Embryoner lagt af vildtype Bristol (N2) og HIF-1 (ia04) deleteringsmutanter alle overlever i hus luften O 2-koncentrationer (210.000 ppm O 2). N 2 orme er i stand til at tilpasse sig og overleve til voksenalderen, 5.000 ppm O 2, mens HIF-1 embryoner ikke er levedygtige. Dette viser, at HIF-1 er nødvendig for at tilpasse til de skiftende mængder af oxygen til rådighed i miljøet 10. Hverken N2 eller HIF-1 dyr kan overleve udsættelse for 1000 ppm O2.
Visualisere orm direkte i hypoxia er muligt ved anvendelse af et dissektionsmikroskop og klar beholder (fig. 3). Ved direkte at anbringe hypoxi kammeret på dissektionsmikroskop, er der intet behov for at fjerne orme fra hypoxia at observere organismal reaktioner. Omfanget kan udstyres med fluorescens illumation (som i figur 3
Figur 1. Eksempel Hypoxia kammeret. Retningen af gasstrømmen er angivet med pile. Gas lagres i komprimeret gas tanke med definerede O 2-koncentrationer (1) og en totrins regulator er fastgjort (2). Ledes ind i bunden af strømningsrøret (3), der forlader toppen på den korrekte strømningshastighed. Gas strømmer derefter ind i boblen flasken (4), hydratiserende gassen (sikrer korrekt forbindelse af boblen kolbe ved at observere bobler). Hydratiseret gas passerer derefter ind i hypoxi kammer ved indstrømningen ventilen (5), udsætte prøverne for hypoksi. Den gas endelig udluftninger ind i rummet gennem en udstødning hul boret i kammeret.
Figur 2. Levedygtighed embryoer udsat for 1000 ppm O2, 5000 ppm O
Figur 3. Visualisering af C. elegans i hypoksi med mikroskopi. orme udsættes for hypoksi under anvendelse af de skitserede metoder. Den gennemsigtige miljøkammeret (konstrueret med en pyrex krystallisering fad og glasplade) er placeret direkte på scenen af et dissektionsmikroskop. To synspunkter er vist, en herunder hele gasstrømmen nedsat, den anden med kun kammeret på mikroskopbordet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne fremgangsmåde giver en strategi til konstruktion af et hypoksisk miljø, der tillader miljøer med nøjagtige koncentrationer af oxygen, der skal holdes i laboratoriet. Disse kamre tilvejebringe en enkel fremgangsmåde til at udsætte organismer til specifikke lave koncentrationer af O2 og overvågning af molekylære og fysiologiske udgange. Den miljømæssige beskrevne kammer samles ved laboratoriet i stedet for kommercielt indkøbte og således kan modificeres til at passe til behovene for eksperimentet.
En klar fordel ved denne fremgangsmåde er den kontinuerlige strøm design. Dette eliminerer de problemer, som normalt optræder med opretholdelse lave koncentrationer af O2 i kamrene, når den eksterne O2 koncentration er meget højere (210.000 ppm O2 i stueluft). Alternativet er en stopped-flow-metoden, ved hvilken et hypoksisk miljø opretholdes i et forseglet kammer. Selv små utætheder, som kan være svære at opdage, preudluftes opretholdelse af hypoxiske betingelser under anvendelse af stopped-flow metoder. Den kontinuerlige flow metoden kontinuerligt udveksling luften i kammeret med den definerede iltkoncentrationen i tryklufttanken og vedligeholder et positivt tryk, der forhindrer lækager fra at forstyrre de hypoxiske forhold.
Indhentning af præcise, præ-blandede iltkoncentrationer fra gasleverandøren løser et vanskeligt problem med hypoxi. Det er ganske vanskeligt at måle meget lave koncentrationer af O2. De fleste O 2 sensorer er diffusion begrænset og temmelig dyrt. Fordi O 2 diffunderer langsomt, kan måle lave O 2-koncentrationer være langsom eller unøjagtig 21. I modsætning hertil er det meget let at generere gasblandinger ved at måle vægten af gasser. Blandingerne vi løbende køber er certificeret standard, at være inden for 2% O 2-indholdet i den ønskede blanding.
Denne fremgangsmåde kan anvendes til at fremkalde observerbare hypoxia-inducerede ændringer både på organismal og molekylært niveau. Selv om denne fremgangsmåde beskrives overlevelse assays og hurtig hele orm isolering af molekylære eksperimenter, der er utallige nedstrøms aflæsning, som kan anvendes. For eksempel tillader denne udformning til retningen visualisering af orme i hypoksi til undersøgelse af tidstro adfærd og ændringer reporterkonstruktioner. For at visualisere orme med et dissektionsmikroskop, samle kammeret ved hjælp af gennemsigtige kasser med lille volumen og minimal højde. Hele kammeret kan anbringes på dissektionsmikroskop og er let at manøvrere for optimal visualisering (se figur 3). Det ville også være muligt at observere prøver ved højere forstørrelse ved hjælp af perfusion kamre med et omvendt mikroskop. Dette kræver en vis tilpasning af kamrene til at interface det med rør, der normalt anvendes til gasstrømmen, og bestemme en passende strømningshastighed. De repræsentative viste resultater kun ridse overfladen af eksperimentel muligheheder, som hypoxi har vist sig at påvirke cellulære systemer fra DNA-syntese til proteinnedbrydning 22,23.
Den praktiske beskaffenhed af denne fremgangsmåde er ikke begrænset til C. elegans. Så længe passende størrelse kamre anvendes, denne metode kan let tilpasses til næsten alle modelsystem. For tilpasning til flydende medier eller cellekultur, oxygendiffusion konstanter i opløsning, afgasning af plast og tid til at ækvilibrere i kultur skal tages i betragtning, og det kan være mest hensigtsmæssigt at anvende O 2 permeable dyrkningsplader 24,25.
Det er muligt at modificere de kamre, der præsenteres i denne protokol til anvendelse sammen med andre gasser. For eksempel kan kamre kan tilpasses til at tilvejebringe en anoxisk miljø blot ved at udelade O2 i den komprimerede gas tankene anvendes til at skabe en hypoksi kammer (idet resten er fyldt med nitrogen). Dette har givet mulighed for observation af C. elegans i suspendte animation (data ikke vist) 10,13,26. Svage modifikationer skal udføres på basis af egenskaberne af den anvendte gas blandingen. Sammensætningen af røret anvendt til røret gas ind i og ud af kammeret kan være nødvendigt at variere. Nogle plast er gennemtrængeligt for CO 2, mens andre ikke er kompatible med ætsende gasser sådan har hydrogensulfid (H 2 S) 16,26. En liste over kompatible plast kan findes på Cole-Parmer hjemmeside.
For toksiske gasser gasudløbet fra kammeret skal udluftes til en certificeret stinkskab og egnede personlige beskyttelse, såsom detektorer, der skal anvendes. Derudover bør EH & S officerer høres, før du begynder ethvert eksperiment ved hjælp af potentielt farlige gasser. Ætsende gasser kan også kræve særlig opmærksomhed. For eksempel kan H2S korroderer mange af de plastmaterialer, der anvendes i standard rørmateriale samt messing montering vil korrodere. Vi plejer at sørge for, at enhver vådTED plast er Kalrez eller tilsvarende instrumenter, der anvendes sammen med H 2 S. Visse gasser kan interagere med urenheder i ledningsvand, så DIH 2 0 bør anvendes i boblen kolben. Særlige overvejelser vedrørende glas kan også være nødvendigt, for eksempel, nødvendiggør H 2 S udstyret med fugtet O-ringe.
Både organismal og molekylære forandringer er observeret udnytte eksperimenter, som kan gennemføres på en dag. Denne evne til hurtigt at indføre prøver til hypoxi giver et værdifuldt redskab i felter fra aldring og kræft til udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker medlemmerne af Miller laboratoriet for diskussion og kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en ny Investigator Award fra Nathan Shock Center of Excellence i Basic Biology of Aging til DLM og National Institutes of Health Prisen R00 AG030550 til DLM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8" FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8" PTFE)’ R-3603 | |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16") 06363-62 (F. coupler 1/16") 06363-60 (M. coupler 1/8") 06363-61 (F. coupler 1/8") | |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) | |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order | |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16") | |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order | |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4" nut) B-200-3 (1/8" union tee) B-400-set (1/4" ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8" male conn) | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) | |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) | |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
References
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30 (2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer. Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).
- Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).
- Ramirez-Bergeron, D. L. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development. 131, 4623-4634 (2004).
- Staff, F. E. Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia. Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).
- Shen, C., Powell-Coffman, J. A. Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans. Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).
- Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).
- Epstein, A. C. R. C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation. Cell. 107, 43-54 (2001).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Gray, J. M. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430, 317-322 (2004).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause. Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hu, C. -J., Wang, L. -Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation. Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).
- Treinin, M. HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).
- Miller, D. L., Roth, M. B. Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans. PNAS. 104, 20618-20622 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Salceda, S., Caro, J. Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).
- Theilacker, J. C., White, M. J. Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement. AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).
- Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts. Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).
- Probst, G., Riedinger, H. Jr, Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells. Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).
- Semenza, G. L., Sen, C. K. Oxygen Sensing. 381, Academic Press. (2004).
- Chan, K., Roth, M. B. Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression. Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).
- Nystul, T. G., Roth, M. B. Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans. PNAS. 101, 9133-9136 (2004).
